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ANALIS

ISOPAL™ Plus Alkaline phosphatase kit for Beckman Coulter Paragon® Electrophoresis - DE: Gebrauchsanweisung

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1. General

Datum: September-03 - Revision: 01

Europäische Artikelnummer 844111011
Artikelnummer 10-004140
100 Tests pro Kit

2. Beabsichtigte Verwendung

Das ISOPAL Plus* alkalische Phosphatase- (AP) Isoenzym-Elektrophorese-Kit zur Verwendung in Beckman Coulters Paragon® Elektrophorese-System dient der elektrophoretischen Trennung von Knochen-, Leber-, intestinalen, plazentalen und makromolekularen Formen von alkalischen Phosphatase-Isoenzymen im Humanserum.

3. Testprinzip

Das menschliche, alkalische Phosphatase-Enzym ist Teil einer Gruppe von Enzymen (Phosphor-Monoester-Hydrolasen), die die Hydrolyse und den Transfer einer Phosphatgruppe bei alkalischem pH-Wert katalysieren.

Das ISOPAL Plus AP Isoenzym-Kit sorgt für die elektrophoretische Trennung von AP-Isoenzymen in einem gepufferten Agarose-Gel. Nach der Elektrophorese werden die Isoenzyme im Gel durch die folgende, spezifische kolorimetrische chemische Reaktionsfolge erkannt:

5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat (BCIP) + AP à Dihalogenhaltiges Indoxyl (mit O2) à dimerisiert zu einem unlöslichen Blau

Die indigoblaue Färbung bildet sich an der Seite jedes Isoenzym-Bands. Dieses Muster kann visuell ausgewertet oder mit einem Densitometer gescannt werden.

4. Inhalt

Äquilibrationspuffer (Trisborat 0,4 mol/l) 2 x 100 ml (Artikelnummer 10-004141)

Elektrophoresepuffer (Trisborat 4,4 mol/l) 1 x 100 ml (Artikelnummer 10-004142)

Substratlösung  A' (BCIP in 2-Amino-2-Methyl-1-Propanol) 1 x 12,5 ml (Artikelnummer 10-004143)

Substratlösung  B' (Nitroblaue Tetrazolium-Lösung) 1 x 12,5 ml (Artikelnummer 10-004145)

Isopal Agarose-Gels: 1 x 10

25 ml-Maßbecher1x

Flüssigkeits-Maßpipette (3 ml) 1x

Proben-Auftragsschablone (purpurrot) 1 x10

Schablonen-Blotter 1 x 10 (19 x 126 mm)

Gel-Blotter 30 (83 x 101 mm)

Trocknungs-Blotter 20 (76 x 101 mm)

5. Konfiguration des Instruments

- Paragon® Elektrophorese-System von Beckman Coulter

6. Andere Reagenzien und benötigte Materialien

  • Pipetten - Maßzylinder
  • Deionisiertes Wasser
  • 5% Essigsäure
  • Paragon® Elektrophorese
  • System von Beckman Coulter

INSTRUMENT (OPTIONAL)

Ein Densitometer, mit dem 7,5 x 10 cm große Folien bei 600 nm gescannt werden können. Eine ausführliche Beschreibung der Anwendungs- und Kalibrierungsverfahren finden Sie in der Anleitung des Herstellers.

7. Schulung

Der Bediener muss mit dem Paragon Elektrophorese-System von Beckman Coulter vertraut sein.

8. Reagenz-Vorbereitung und -Lagerung

ISOPAL-Gels: Entfernen Sie das Gel unmittelbar vor der Verwendung aus der Folienverpackung. Gels müssen bis Ablauf des Haltbarkeitsdatums bei Raumtemperatur (8 °C bis 30 °C) gelagert werden. Falsche Temperatur- oder Lagerbedingungen können zu atypischen Migrationen führen. LAGERN SIE GELS NICHT IN DER NÄHE VON WÄRMEABSTRAHLENDEN GERÄTEN. Zum Beispiel: Kathodenstrahlröhren, Computer oder Tischgeräte. KÜHLEN SIE DAS GEL NICHT UND FRIEREN SIE ES NICHT EIN

. ISOPAL Arbeits-Äquilibrationspuffer: gebrauchsfertig.

ISOPAL Arbeits-Elektrophoresepuffer, pH 9,5: Den Inhalt einer Elektrophoresepufferflasche (100 ml) mit 900 ml deionisiertem Wasser verdünnen. Ungeöffneter Puffer ist bei Raumtemperatur (8 °C bis 30 °C) bis Verfallsdatum haltbar. Verdünnter Arbeitspuffer, aufbewahrt bei Raumtemperatur (8 °C bis 30 °C) in verschlossener Flasche ist 60 Tage bzw. bis Verfallsdatum haltbar. Trübe gewordenen Puffer nicht mehr verwenden.

ISOPAL-Substrat: Inhalt von Flasche B in Flasche A gießen und mischen.

4 Wochen haltbar.

9. Mustertyp

Als Probenmaterial wird Humanserum eingesetzt. Frisches Nüchternserum ist zu empfehlen. Proben können bis zu 72 Stunden bei 4 °C aufbewahrt werden. Bei späterer Analytik sollten Proben kühl gelagert werden. Gekühlte Proben müssen jedoch vor Analyse durch Inkubation bei 37 °C für 30 Minuten reaktiviert werden. Hämolytisches Probenmaterial sollte nicht eingesetzt werden.

HINWEIS

Mit Oxalat, Zitronensäure oder EDTA abgenommenes Plasma hemmt die Aktivität der alkalischen Phosphatase.

10. Vorbereitung des Instruments

Siehe Paragon® Elektrophorese-System.

11. Probenvorbereitung

Serum-Proben werden nicht verdünnt.

12. Betrieb

1. Die ISOPAL-Gel-Folienverpackung öffnen und den Gel-Behälter entnehmen.

2. Gel-Behälter vollständig öffnen (Ober- und Unterseite des Behälters müssen flach auf einer ebenen Fläche liegen. Beachten Sie bitte, dass die Unterseite über Rillen verfügt.)

3. Gel aus dem Gel-Behälter nehmen und auf ein Papiertuch legen.

4. 20 ml ISOPAL-Äquilibrationspuffer in den unteren Teil des Gel-Behälters gießen.

5. Überschüssiges Gel mittels Gel-Blotter entfernen. Blotter anschließend entsorgen.

6. Das leicht abgetrocknete Gel behutsam mit der Agarose-Gel-Seite nach unten in den mit Äquilibrationspuffer vorbereiteten Behälter legen. Gel 30 Minuten lang äquilibrieren lassen.

7. Die Proben und Kontrollen wie unter PROBENMATERIAL beschrieben vorbereiten.

8. Gel entnehmen und mit Agarose-Gel-Seite nach oben auf ein Papiertuch legen. Gel-Behälter einschließlich gebrauchtem Äquilibrationspuffer entsorgen.

9 . Vorsichtig Gel mit Gel-Blotter trocken löschen. Blotter anschließend entsorgen.

10. Auflegen der purpurroten Schablone:

figure 1

(a) Halten Sie die Auftragschablone wie abgebildet an der Längsseite fest.
(b) Die kleinen Löcher der Schablone mit den mit "A" gekennzeichneten Punkten an den Kanten der Gel-Folie ausrichten.
® Vorsichtig Schablone auflegen, so dass die Schlitze mit der Gel-Oberfläche leichten Kontakt erhalten, diese aber nicht beschädigen.
(d) Mit dem Finger leicht über die aufliegende Schablone streichen, damit sie dicht aufliegt.

11. Jeweils 5 µl Probe vorsichtig über den Probenschlitzen verteilen. Nach Pipettierung der letzten Probe 10 Minuten diffundieren lassen.

12. Überschüssige Probe vorsichtig mit dem Schablonen-Blotter ablöschen. Blotter und Schablone entsorgen.

13. 45 ml Puffer in jedes Fach der Elektrophoresezelle gießen.

14. Die Gel-Folie in die Gel-Brücke einspannen, dabei  + und  - Markierungen auf der Gel-Folie und der Gel-Brücke beachten. Die Gel-Brücke mit Folie in die Paragon Elektrophoresezelle stellen und den Deckel schließen.

15. Die Paragon Elektrophoresezelle in das Netzgerät schieben. Die Spannung auf 150 Volt einstellen und Netzgerät einschalten. Die Elektrophorese-Trennzeit beträgt 25 Minuten.

16. Nach der elektrophoretischen Trennung die Gel-Brücke mit der Gel-Folie aus der Elektrophoresezelle heben, die Folie von der Brücke nehmen und in eine Paragon Inkubationsbox legen.

HINWEIS
Inkubationsbox bitte NUR für ISOPAL AP-Isoenzyme verwenden.

17. 2,5 ml ISOPAL-Substrat gleichmäßig mittels mitgelieferter Pipette auf der Gel-Oberfläche verteilen. VERMEIDEN SIE EINE BERÜHRUNG DER OBERFLÄCHE MIT DER PIPETTE.

18. Inkubationsbox schließen und für 15 Minuten in den Paragon Inkubator (45 °C) stellen.

19. Horizontale Position der Inkubationsbox überprüfen, so dass das Substrat gleichmäßig auf dem Gel verteilt bleibt.

20. Nach 5 Minuten Inkubationszeit Inkubationsbox öffnen und vorsichtig schwenken, um das Substrat erneut gleichmäßig über der gesamten Gel-Oberfläche zu verteilen. Inkubation fortsetzen.

21. Nach Inkubation Gel-Folie in der Inkubationsbox 5 Sekunden lang mit 20 ml deionisiertem Wasser und anschließend 5 Minuten lang mit 20 ml 5%iger Essigsäure spülen.

22. Gel-Blotter auf dem Boden des Presstrockners legen.

23. Gel-Folie mit Agarose-Gel-Seite nach oben auf den Gel-Blotter im Presstrockner legen.

24. Ein zweiten, mit 5%iger Essigsäure benetzten Gel-Blotter auf die Gel-Oberfläche legen, darauf 2 Trocknungs-Blotter und die obere Platte des Presstrockners legen. 2 Minuten lang presstrocknen.

25. Spülung mit Essigsäure wiederholen und erneut presstrocknen.

26. Gel-Folie in Trockenofen legen, bis es trocken ist (maximale Temperatur: 90 °C).

27. Gel-Folie visuell beurteilen oder mittels eines geeigneten Densitometers bei 600 nm scannen.

BESTÄTIGUNGSVERFAHREN

1. Inkubation mit Neuraminidase: 100 µl Probe mit 20 µl ISOPAL-Neuraminidase (Beckman Coulter-Artikelnummer 446145) mischen und für 30 Min. bei 37 °C inkubieren. Die unbehandelte Probe sowie die mit Neuraminidase inkubierte Probe nebeneinander auf dem Gel auftragen und normal prüfen.

HINWEIS
Die Neuraminidase zeigt herstellerabhängig große Aktivitätsunterschiede. Um eine gleichbleibende chargenunabhängige Aktivität zu gewährleisten, sollte nur die ISOPAL-Neuraminidase verwendet werden.

2. Behandlung mit antiplazentarem Antiserum: 100 µl Serum mit 20 µl antiplazentarem ISOPAL-Antiserum (Beckman Coulter-Artikelnummer 446140) mischen. Die behandelte Probe unverzüglich auf das Gel auftragen.

HINWEIS
Das antiplazentare Antiserum reagiert sowohl mit plazentaren wie auch mit intestinalen Isoenzymen. Wenn eine intestinale oder plazentale Fraktion vorhanden ist, erscheint der Komplex mit Antiserum dann im Gamma-Bereich. Auch wenn die Farbintensität des Komplexes gering ist, ist das Verschwinden dieser Fraktionen von der ursprünglichen Stelle offensichtlich. Um eine gleichbleibende chargenunabhängige Aktivität zu gewährleisten, sollte nur das antiplazentare ISOPAL-Antiserum verwendet werden.

3. Inkubation mit Ficin: 5 mg ISOPAL-Ficin (Beckman Coulter-Artikelnummer: 446150) zu 100 µl Probe hinzufügen und für 30 Min. bei 37 °C inkubieren. Unbehandelte Probe und mit Ficin inkubierte Probe nebeneinander auf das Gel auftragen und normal prüfen.

WARNHINWEIS
Reizende Stoffe. Vermeiden Sie den Kontakt mit Augen und Haut. Atmen Sie keine Dämpfe ein. Kontaminierten Bereich gründlich mit Wasser spülen.

13. Kalibration

Die Durchführung der Kalibration des Densitometers ist der Gebrauchsinformation des Herstellers zu entnehmen.

14. Analyse der Ergebnisse:

figure 2

Das AP-Isoenzym-Muster kann visuell ausgewertet werden, indem die unbehandelte Probe mit der behandelten Probe verglichen wird. Mit Hilfe eines Densitometers ist es möglich, prozentuale Ergebnisse für jedes einzelne AP-Isoenzym zu errechnen.

DIFFERENZIERUNG UND IDENTIFIKATION VON FRAKTIONEN MITTELS BESTÄTIGUNGSVERFAHREN

1. Knochen-Leber-Differenzierung: Nach der Inkubation mit ISOPAL-Neuraminidase erscheinen zwei deutlich aufgelöste Bänder, die stärker als die unbehandelte kathodisch wandern. Es ist zu beachten, dass diese Bänder jede in der Probe vorhandenen intestinalen Fraktionen überdecken können.

2. Identifikation einer intestinalen Fraktion und/oder intestinalen Variante: (a) Eine 24-stündige Proben-Inkubation mit ISOPAL-Neuraminidase durchführen. Intestinale Fraktionen verbleiben an ursprünglicher Stelle, während sich Knochen- und Leberfraktionen kathodisch verlagern. (b) Probe mit antiplazentarem ISOPAL-Antiserum mischen. Diese Fraktionen verschwinden von der ursprünglichen Stelle und erscheinen zwischen der Auftragstelle und der Kathode.

3. Identifikation der plazentaren Fraktionen: (a) Bei Inkubation der Probe mit ISOPAL Neuraminidase verlagern sich die Fraktionen kathodisch. (b) Probe mit antiplazentarem ISOPAL-Antiserum mischen. Fraktionen verschwinden und tauchen an einer neuen Stelle zwischen Auftragstelle und Kathode wieder auf.

4. Identifikation proteingebundener Fraktionen: Nach Mischen der Probe mit ISOPAL-Ficin werden Knochen- und/oder Leberfraktionen regeneriert, und der Komplex an der Auftragstelle verschwindet.

5. Identifikation von Polymeren der Leberfraktionen: Nach Mischen der Probe mit ISOPAL-Ficin regeneriert die Leberfraktion, und der Komplex an der Auftragstelle verschwindet.

15. Berechnung

Es sind keine Berechnungen erforderlich

16. Ungenauigkeiten

Der Variationskoeffizient liegt normalerweise unter 5 %.

17. Referenzbereich

Die AP-Aktivität und die Isoenzym-Verteilung sind bei Normalpersonen vom Alter, Geschlecht, genetischen Gesichtspunkten und dem Vorhandensein einer Schwangerschaft abhängig. Knochen-Isoenzyme werden bei Kindern und bei Erwachsenen über 50 Jahre ausgewertet. Die Darm-Isoenzyme bei Personen mit Blutgruppe B oder 0, die sekretor-positiv sind, können besonders nach einem fetthaltigen Essen ausgewertet werden. Plazentare Isoenzyme werden während und kurz nach einer Schwangerschaft gemessen.

Unter Umständen kann die AP-Aktivität und die Verteilung der Isoenzyme auch durch eine Reihe von anderen klinischen Bedingungen modifiziert werden. Die Auswertung der elektrophoretischen Muster setzt voraus, dass die AP-Gesamtaktivität in den Patientenproben bekannt ist.

Die folgenden Werte wurden für den alkalinen Paragon ISOPAL Phosphatase Isoenzym-Kit aufgezeichnet. Die Versuchsgruppe bestand aus 66 offensichtlich gesunden, erwachsenen Männern und Frauen (im Alter von 25 bis 50 Jahren) aus Süd-Kalifornien. Die AP-Gesamtwerte lagen im Bereich von 32 bis 107 IU/l (37 °C ASTRA).

AP-Isoenzyme % der AP-Gesamtaktivität
Knochen 14,8 bis 73,5
Leber 30,1 bis 85,7
Intestinal 4.3 bis 10.9
Makromolekular 2.7 bis 4.9

Es wird empfohlen, dass jedes Labor seinen individuellen Normalbereich ermittelt.

18. Interferenzen

1. Gele, die nicht horizontal gelagert wurden, können atypische Elektrophoresemuster zeigen.

2. Bei hämolytischen Proben kann die Gesamt-AP verringert sein. Bei diesen Proben kann aufgrund der Hämolyse ein Artefakt innerhalb der Knochenfraktion entstehen.

3. Wurde nach der Inkubation kein deionisiertes Wasser verwendet (zwei Arbeitsschritte: Verdünnen des Puffers und Waschen des Gels), können während der elektrophoretischen Trennung Risse entstehen und Proteine während des Spülvorgangs ausgefällt werden.

19. Qualitätskontrolle

Es wird empfohlen, frische Seren oder, falls verfügbar, kommerzielle Kontrollseren in jedem Trennungslauf mitzuführen.

20. Referenzen

Van Hoof V, Lepoutre L, De Broe M, Hoylaerts M, Chevigné R.

Improved Agarose Electrophoresis Method for Separating Alkaline Phosphatase Isoenzymes in Serum. Clin Chem 1988;34:1857-62. (Reprint R577).


Van Hoof V, Hoylaerts M, Geryl H, Van Mullem M, Lepoutre L, Debroe M.

Age and Sex Distribution of Alkaline Phosphatase Isoenzymes by Agarose Electrophoresis. Clin Chem 1990;36:875-8.


Van Hoof V, Van Oosterom A, Lepoutre L, De Broe M.

Alkaline Phosphatase Isoenzymes Patterns in Malignant Disease. Clin Chem 1992;38:2546-51.


Van Hoof V, De Broe M.

Interpretation and Clinical Significance of Alkaline Phosphatase Isoenzyme

Patterns. Crit Rev Clin Lab Sci 1994;31:197-293.


Van Hoof V, Martin M, Blockx P, Prove A, Van Oosterom A, Couttenye M, De Broe M, Lepoutre L.

Immunoradiometric Method and Electrophoresis System Compared for Quantifying Bone Alkaline Phosphatase in Serum. Clin Chem 1995;41:853-7.

Analis-Broschüren:

B 23 E9111 Clinical Significance of Alkaline Phosphatase Isoenzymes.

B 24a E9404 Improved Agarose Electrophoresis Method for Separating, Quantifying and

Identifying Alkaline Phosphatase Isoenzymes in Serum.

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