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ANALIS

ISOPAL™ Plus Alkaline phosphatase kit for Beckman Coulter Paragon® Electrophoresis - ES: Instrucciones de uso

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1. General

Fecha: Septiembre 2003 - Revisión: 01
EURO PN 844111011
PN 10-004140
100 pruebas por kit

2. Uso previsto

El Estuche de electroforesis para isoenzimas de fosfatasa alcalina (AP) ISOPAL Plus* se utiliza con el Sistema de electroforesis Beckman Coulter Paragon® para la separación electroforética de los tipos óseo, hepàtico, intestinal, placentario y macromolecular de las isoenzimas de fosfatasa alcalina en suero humano.



3. Principio del ensayo

La fosfatasa alcalina humana forma parte de un grupo de enzimas (hidrolasas de monoéster fosfórico) que catalizan la hidrólisis y transferencia de un grupo fosfato a pH alcalino.

El Estuche para isoenzimas AP ISOPAL Plus permite la separación electroforética de isoenzimas AP en un gel de agarosa tamponado. Después de la electroforesis, las isoenzimas presentes en el gel se detectan mediante la siguiente secuencia de reacciones químicas colorimétricas específicas:

5-bromo-4-cloro-3-indolilo fosfato (BCIP) + AP à indoxilo dihalogenado (con O2) à se dimeriza a azul insoluble

Cada una de las bandas de isoenzimas queda coloreada con azul índigo. El gel electroforético puede interpretarse visualmente o explorarse mediante un densitómetro.



4. Contenido

Tampón Equilibrador (TRIS borato 0,4 mol/l) 2x100ml (PN 10-004141)

Tampón Electroforético (TRIS borato 4,4 mol/l)1x100ml (PN 10-004142)

Solución sustrato 'A' (BCIP en 2 amino-2-metil-1-propanol) 1x12,5ml (PN 10-004143)

Solución sustrato 'B' (Solución de azul de nitro-tetrazolio) 1x12,5ml (PN 10-004145)

Geles de azarosa Isopal: 1x10

Medir 25 ml 1x

Pipeta para líquidos graduada (3ml) 1x

Plantilla para la muestra (color violeta) 1x10

Secantes para plantillas 1x10 (19x126mm)

Secantes para geles 30 (83 x 101 mm)

Secantes absorbentes 20 (76 x 101mm)



5. Configuración del aparato

  • Sistema de electroforesis Beckman Coulter Paragon ®.



6. Otros reactivos y materiales necesarios

  • Pipetas.
  • Bureta graduada.
  • Agua desionizada.
  • Ácido acético al 5%
  • Sistema de electroforesis Beckman Coulter Paragon ®.

INSTRUMENTAL (OPCIONAL)

Un densitómetro capaz de explorar gel electroforético de 7,5 cm x 10 cm a 600 nm. Consultar las especificaciones del fabricante sobre los procedimientos de calibración y operación.



7. Formación

El operador deberá estar familiarizado con el Sistema de electroforesis Beckman Coulter Paragon®.



8. Preparación de reactivos y almacenamiento

Geles ISOPAL: Inmediatamente antes de usarlo, sacar el gel de su envoltorio de aluminio cuidadosamente. Los geles deben almacenarse a temperatura ambiente entre 8°C y 30°C hasta su fecha de caducidad. Una temperatura o condiciones de almacenamiento inadecuadas pueden ocasionar migraciones atípicas. No almacene los geles cerca de dispositivos que emitan calor, como por ejemplo monitores, ordenadores, o instrumentos de sobremesa. NO REFRIGERAR NI CONGELAR.

Tampón Equilibrador ISOPAL de trabajo: Listo para usar.

Tampón electroforético de trabajo ISOPAL, pH 9,5: Diluir el contenido de un frasco de Tampón electroforético (100 ml) en 900 ml de agua desionizada. El tampón sin abrir debe almacenarse a temperatura ambiente, entre 8°C y 30°C hasta su fecha de caducidad. El tampón diluido almacenado en un recipiente cerrado a temperatura ambiente, entre 8°C y 30°C, permanece estable por 60 días o hasta su fecha de caducidad, si ésta es anterior. Si el tampón se vuelve turbio, es preciso desecharlo.

Sustrato ISOPAL: verter el contenido del frasco B en el frasco A y mezclar.

Permanece estable durante 4 semanas.



9. Tipo de muestra

Las muestras de suero deben obtenerse siguiendo los procedimientos normales para cualquier prueba de laboratorio. Se prefiere utilizar suero recientemente extraído de un individuo en ayunas, aunque las muestras pueden almacenarse a 4°C durante un período de hasta 72 horas para su posterior anàlisis. Las muestras refrigeradas deben reactivarse, incubándolas a una temperatura de 37°C durante 30 minutos antes de analizarlas. No deben usarse muestras que presenten indicios de hemólisis.

NOTA

Al recolectar plasma con oxalato, àcido cítrico o EDTA se inhibe la actividad de la fosfatasa alcalina.



10. Preparación del equipo

Véase el sistema de electroforesis Paragon ®



11. Preparación de la muestra

No hay que diluir las muestras de suero.



12. Operaciones

1. Abrir y retirar la bandeja para geles del envoltorio de aluminio del gel ISOPAL.

2. Abrir completamente la bandeja para geles. (Los extremos superior e inferior de la bandeja deben quedar planos al apoyarlos sobre una superficie nivelada. Observe que la porción inferior presenta ranuras.)

3. Quitar el gel de la bandeja y colocarlo sobre una toalla de papel.

4. Verter 20 ml de Tampón equilibrador ISOPAL en la parte inferior de la bandeja para geles.

5. Secar suavemente el gel con el secante para geles. Desechar el secante.

6. Colocar con sumo cuidado el gel seco, con el lado de agarosa hacia abajo, en el tampón equilibrador. Dejarlo equilibrar durante 30 minutos.

7. Preparar las muestras y controles de acuerdo a las instrucciones de la sección OBTENCION DE ESPECIMENES.

8. Quitar el gel de la bandeja y colocarlo sobre una toalla de papel, con el lado de agarosa hacia arriba. Desechar la bandeja para geles con el Tampón equilibrador usado.

9 . Secar suavemente el gel con el secante para geles. Desechar el secante.

10. Aplicación de la plantilla púrpura:

figure 1

(a) Combar la plantilla longitudinalmente, de acuerdo a la ilustración anterior.

(b) Alinear la plantilla con los puntos de posición  A" ubicados en los bordes del gel.

® Colocar la plantilla sobre el gel de modo que sus ranuras entren en contacto con la superficie del mismo.

(d) Levemente pasar el dedo a lo largo de la plantilla para asegurar el contacto.

11. Aplicar 5 µl de muestra en cada una de las ranuras de la plantilla. Esperar diez minutos después de la última aplicación, para asegurar la difusión de la muestra.

12. Secar suavemente la plantilla con el secante para plantillas. Desechar el secante y la plantilla.

13. Verter 45 ml de tampón en cada compartimiento de la celda de electroforesis.

14. Colocar el gel en el puente para geles de la celda, alineando los lados positivo (+) y negativo (-) del gel con las posiciones correspondientes indicadas en el puente para geles. Colocar el conjunto en la celda de electroforesis Paragon y taparla.

15. Colocar la celda de electroforesis en la fuente de alimentación. Fijar el voltaje a 150 voltios, encender y permitir que el proceso de electroforesis se verifique durante 25 minutos.

16. Una vez completado dicho proceso, quitar el gel de la celda de electroforesis Paragon y colocarlo en un caja de incubación Paragon.

AVISO

Utilizar la caja de incubación SOLO para isoenzimas de fosfatasa alcalina ISOPAL.

17. Esparcir 2,5 ml de substrato ISOPAL uniformememte sobre la superficie del gel con la pipeta para líquidos. EVITAR TOCAR LA SUPERFICIE DEL GEL con la Pipeta para líquidos.

18. Cerrar la caja de incubación y colocarla en la incubadora Paragon (a 45°C) durante 15 minutos.

19. Compruebe que la caja de incubación se encuentra en posición horizontal de forma que el sustrato permanezca distribuido de manera uniforme sobre el gel.

20. Al transcurrir 5 minutos de incubación, abrir la caja de incubación y esparcir el substrato uniformememte sobre la superficie del gel. Continuar la incubación.

21. Después de la incubación, lavar el gel en la caja de incubación con 20 ml de agua desionizada durante 5 segs y, a continuación, con 20 ml de ácido acético al 5% durante 5 minutos.

22. Coloque el secante para geles en el fondo de la prensa de secado.

23. Coloque el gel, con el lado de la agarosa hacia arriba, sobre el secante para geles en el fondo de la prensa de secado.

24. Coloque otro secante para geles empapado en ácido acético al 5%, seguido de dos secantes absorbentes y la pletina superior de la prensa de secado. Prensar en seco durante 2 minutos.

25. Repetir el lavado con ácido acético y el prensado en seco.

26. Colocar el gel en el horno de secado hasta que se seque (a 90ºC como máximo)

27. Evaluar el gel visualmente o explorar con un densitómetro adecuado a 600 nm.

METODOS DE CONFIRMACION

1. Incubación con Neuraminidasa: Mezclar 100 µl de muestra con 20 µl de Neuraminidasa ISOPAL (Beckman Coulter P/N 446145). Incubar durante 30 minutos a 37°C. Aplicar la muestra original y la muestra incubada al mismo gel y procesar normalmente.

AVISO

Dependiendo de los proveedores, se ha observado una gran diversidad en el comportamiento de la neuraminidasa. Para obtener resultados óptimos, utilizar Neuraminidasa ISOPAL para asegurar la misma actividad lote a lote.

2. Tratamiento con Antisuero Antiplacentario: Mezclar 100 µl de suero con 20 µl de Antisuero Antiplacentario ISOPAL (Beckman Coulter P/N 446140) y aplicar al gel de inmediato.

AVISO

De hallarse presentes isoenzimas intestinales y placentarias, se verificarà una reacción cruzada. Si se hallan presentes fracciones intestinales o placentarias, el complejo formado con el antisuero aparecerà en la región gamma. Ademàs, si bien la intensidad del color del complejo podrà ser mínima, la desaparición de las fracciones de sus ubicaciones originales resultarà evidente. Para obtener resultados óptimos, usar Antisuero Antiplacentario ISOPAL con actividad optimizada (especificidad, títulos).

3. Incubación con Ficina: Agregar 5 mg de Ficina ISOPAL (Beckman Coulter P/N 446150) a 100 µl de suero e incubar durante 30 minutos a 37°C. Aplicar la muestra original y la incubada al mismo gel y procesar normalmente.

PRECAUCION

Irritante. Evite el contacto con la piel y los ojos. No respirar el polvo. Enjuagar el área contaminada completamente con agua.



13. Calibrado

El funcionamiento del densitómetro debe verificarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

14. Análisis de resultados

figure 2

Los resultados obtenidos de las isoenzimas AP pueden interpretarse visualmente comparando el modelo de la muestra con un patrón de control. Con la ayuda de un densitómetro, es posible calcular el porcentaje relativo de las isoenzimas AP.

DIFERENCIACION Y CONFIRMACION DE FRACCIONES UTILIZANDO METODOLOGIAS DE CONFIRMACION

1. Diferenciación de fracciones óseas y hepáticas: Después de la incubación con neuraminidasa ISOPAL, aparecerán dos bandas claramente resueltas que presentan una migración mucho mayor hacia el cátodo. Dichas bandas cubrirán cualquier fracción intestinal que exista en la muestra.

2. Confirmación de fracción intestinal y/o variante intestinal:

(a) Incubar la muestra durante toda una noche con neuraminidasa ISOPAL. Las fracciones intestinales permaneceràn en el mismo lugar, mientras que las fracciones óseas y hepáticas se desplazarán hacia el cátodo.

(b) Mezclar con antisuero antiplacentario ISOPAL. Estas fracciones desaparecerán del emplazamiento original y aparecerán entre el punto de aplicación y el càtodo.

3. Confirmación de fracciones placentarias:

(a) La incubación de muestra con neuraminidasa ISOPAL ocasionará que las fracciones se desplacen hacia el cátodo.

(b) Mezclar la muestra con antisuero antiplacentario ISOPAL. Las fracciones desaparecerán del emplazamiento original y aparecerán entre el punto de aplicación y el càtodo.

4. Confirmación de fracciones enlazadas a proteínas:

Una vez mezclada la muestra con Ficina ISOPAL, la fracción ósea y/o hepàtica se regenerará, desapareciendo el complejo formado en el punto de aplicación.

5. Confirmación de polímeros de fracciones hepáticas:

Después de la mezcla con Ficina ISOPAL, la fracción hepàtica se regenera, desapareciendo el complejo formado en el punto de aplicación.



15. Cálculos

No hay que realizar ningún cálculo.

16. Imprecisión

Los coeficientes de variación se hallan normalmente por debajo del 5%.



17. Límites de referencia

En individuos normales, la actividad de AP, así como la distribución de la isoenzima, dependen de la edad, el sexo, consideraciones genéticas y, en el caso de las mujeres, del embarazo. La isoenzima ósea es más elevada en niños y en adultos mayores de 50 años. Los individuos con sangre tipo B u O y con secreción positiva pueden presentar isoenzimas intestinales elevadas, particularmente después de una comida con alto contenido graso. La isoenzima de la placenta es más elevada durante el embarazo y poco tiempo después de su culminación.

Hay otras condiciones que también modifican la actividad de AP así como la distribución de isoenzimas. Para la interpretación de los resultados electroforéticos debe conocerse la actividad total de AP en las muestras del paciente.

Utilizando el Estuche para isoenzimas de fosfatasa alcalina ISOPAL se observaron los siguientes valores determinados a partir de una población de 66 adultos de ambos sexos aparentemente sanos (de 25 a 50 años de edad) procedentes del sur de California. El rango del total de valores de AP fue de 32 a 107 UI/l (37°C ASTRA).

Isoenzima AP

% del total de actividad de AP

Osea

14,8 a 73,5

Hepàtica

30,1 a 85,7

Intestinal

4,3 a 10,9

Macromolecular

2,7 a 4,9

Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango normal.



18. Interferencias

1. Aquellos geles no almacenados en posición horizontal pueden dar resultados electroforéticos atípicos.

2. En presencia de hemólisis, el AP total puede dar un resultado menor del verdadero. El perfil ISOPAL puede denotar la presencia de una banda artificial dentro de la fracción ósea, causada por la hemólisis.

3. El uso de un líquido que no sea agua desionizada para diluir los tampones y enjuagar los geles después de la etapa de incubación puede causar la ruptura del gel durante el proceso electroforético y también precipitar proteínas durante su procesado en los líquidos.

19. Control de Calidad

Se recomienda incluir suero fresco normal o suero control disponible comercialmente en cada procedimiento electroforético.

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20. Referencias

Van Hoof V, Lepoutre L, De Broe M, Hoylaerts M, Chevigné R.

Improved Agarose Electrophoresis Method for Separating Alkaline Phosphatase Isoenzymes in Serum. Clin Chem 1988;34:1857-62. (Reprint R577).

Van Hoof V, Hoylaerts M, Geryl H, Van Mullem M, Lepoutre L, Debroe M.

Age and Sex Distribution of Alkaline Phosphatase Isoenzymes by Agarose Electrophoresis. Clin Chem 1990;36:875-8.

Van Hoof V, Van Oosterom A, Lepoutre L, De Broe M.

Alkaline Phosphatase Isoenzymes Patterns in Malignant Disease. Clin Chem 1992;38:2546-51.

Van Hoof V, De Broe M.

Interpretation and Clinical Significance of Alkaline Phosphatase Isoenzyme

Patterns. Crit Rev Clin Lab Sci 1994;31:197-293.

Van Hoof V, Martin M, Blockx P, Prove A, Van Oosterom A, Couttenye M, De Broe M, Lepoutre L.

Immunoradiometric Method and Electrophoresis System Compared for Quantifying Bone Alkaline Phosphatase in Serum. Clin Chem 1995;41:853-7.

Textos de Analis:

B 23 E9111 Clinical Significance of Alkaline Phosphatase Isoenzymes.

B 24a E9404 Improved Agarose Electrophoresis Method for Separating, Quantifying and

Identifying Alkaline Phosphatase Isoenzymes in Serum.



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