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ANALIS

ISOPAL™ Plus Alkaline phosphatase kit for Beckman Coulter Paragon® Electrophoresis - IT: Istruzioni per l'uso

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1. General

Data: Settembre 03  Revisione: 01

EURO PN 844111011

PN 10-004240
100 test per kit

2. Finalità di utilizzo

Il Kit ISOPAL Plus* per l'elettroforesi degli isoenzimi della fosfatasi alcalina (AP), concepito per l'uso con il Sistema elettroforetico Paragon® Beckman Coulter, è utilizzabile per la separazione elettroforetica nelle frazioni ossea, epatica, intestinale, placentare e macromolecolare degli isoenzimi della fosfatasi alcalina presenti nel siero umano.

3. Principio del test

L'enzima fosfatasi alcalina umana è parte di un gruppo di enzimi (idrolasi dei monoesteri fosforici) che catalizza l'idrolisi e il trasferimento di un gruppo fosfato a pH alcalino.

Il Kit ISOPAL Plus AP utilizza gel di agarosio tamponato per la separazione elettroforetica degli isoenzimi della AP. Dopo l'elettroforesi, gli isoenzimi presenti nel gel vengono rilevati mediante la sequenza specifica di reazioni chimiche colorimetriche indicata di seguito:

5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) + AP à indossile dialogenato (con O2 ) à dimerizza formando un composto blu insolubile

Il colorante blu indaco si forma in corrispondenza di ciascuna banda di isoenzima. Questo pattern può essere interpretato visivamente o analizzato tramite densitometro.

4. Contenuto

Tampone per equilibrazione (TRIS-borato 0,4 mol/L) 2x100 mL (PN 10-004141)

Tampone per elettroforesi (TRIS-borato 4,4 mol/L) 1x100 mL (PN 10-004142)

Soluzione Substrato 'A' (BCIP in 2-ammino-2-metil-1-propanolo) 1x12,5 mL (PN 10-004143)

Soluzione Substrato 'B' (nitroblu di tetrazolio) 1x12,5 mL (PN 10-004145)

Gel di agarosio ISOPAL: 1x10

Contenitore graduato 25 mL 1x

Pipetta graduata per liquidi (3 mL) 1x

Mascherina per campioni (viola) 1x10

Assorbenti per mascherina 1x10 (19 x 126 mm)

Assorbenti per gel 30 (83 x 101 mm)

Assorbenti per essiccazione 20 (76 x 101mm)

5. Configurazione dello strumento

- Sistema elettroforetico Paragon ® Beckman Coulter

6. Altri reagenti e materiale necessario

- Pipette.

- Cilindro graduato.

- Acqua deionizzata.

- Acido acetico 5%.

- Sistema elettroforetico Paragon ® Beckman Coulter

STRUMENTO (OPZIONALE)

Densitometro con possibilità di effettuare la scansione di supporti da 7,5 x 10 cm a 600 nm. Per le procedure d'uso e calibrazione, consultare le istruzioni della casa produttrice.

7. Formazione

L'operatore deve conoscere il sistema elettroforetico Paragon di Beckman Coulter.

8. Preparazione dei reagenti e stoccaggio

Gel ISOPAL: solo prima dell'uso rimuovere delicatamente il gel dal contenitore sigillato. I gel devono essere conservati a temperatura ambiente di 8°C a 30°C, fino alla data di scadenza. Temperature o condizioni di conservazione non adeguate possono causare migrazioni atipiche. NON CONSERVARE I GEL IN PROSSIMITÀ DI FONTI DI CALORE. Ad esempio: CRT, computer o strumentazione da banco. NON REFRIGERARE O CONGELARE.

Tampone di lavoro ISOPAL per equilibrazione: pronto all'uso.

Tampone di lavoro ISOPAL per elettroforesi, pH 9,5: Diluire il contenuto di un flacone di tampone per elettroforesi (100 mL) con 900 mL di acqua deionizzata. Il tampone non aperto deve essere conservato a temperatura ambiente da 8°C a 30°C, fino alla data di scadenza. Il tampone diluito conservato in un contenitore chiuso a temperatura ambiente da 8°C a 30°C, è stabile per 60 giorni, o fino alla data di scadenza, nel caso sia inferiore ai 60 giorni. Se il tampone si intorbida, smaltirlo.

Substrato ISOPAL: versare il contenuto del flacone B nel flacone A e miscelare.

Stabile per 4 settimane.

9. Tipologia di campione

I campioni di siero possono essere raccolti con le normali tecniche usate in laboratorio. È consigliabile l'uso di campioni freschi di siero prelevati da individui a digiuno, ma è possibile conservarli a 4°C per 72 ore. I campioni conservati in frigo devono essere riattivati prima dell'analisi tramite incubazione a 37°C per 30 minuti. I campioni che presentano tracce di emolisi non devono essere usati.

NOTA

Il plasma prelevato con ossalato, acido citrico o EDTA inibisce l'attività della fosfatasi alcalina.

10. Preparazione dello strumento

Vedere sistema elettroforetico Paragon®.

11. Preparazione del campione

I campioni di siero non vengono diluiti.

12. Operazioni

1. Aprire e rimuovere il vassoietto del gel dal contenitore gel ISOPAL.

2. Aprire completamente il vassoietto (la parte superiore e inferiore del vassoietto devono essere disposte orizzontalmente su una superficie piana. Si noti che la porzione inferiore è dotata di scanalature).

3. Rimuovere il gel dal vassoietto e collocarlo su un foglio di carta assorbente.

4. Versare 20 mL di tampone per l'equilibrazione ISOPAL nella parte inferiore del vassoietto.

5. Asciugare il gel con delicatezza, con l'apposito materiale assorbente. Smaltire il materiale assorbente.

6. Posare delicatamente il gel asciugato, con il lato dell'agarosio rivolto verso il basso, nel tampone per l'equilibrazione. Equilibrare il gel per 30 minuti.

7. Preparare tutti i campioni e i controlli come specificato nelle istruzioni RACCOLTA DEI CAMPIONI.

8. Rimuovere il gel e posarlo su un foglio di carta assorbente, con il lato dell'agarosio rivolto verso l'alto. Eliminare il vassoietto contenente il tampone per l'equilibrazione usato.

9 . Asciugare il gel con delicatezza, con l'apposito materiale assorbente. Smaltire il materiale assorbente.

10. Applicazione della mascherina viola:

(a) Piegare la mascherina nel senso della lunghezza, come illustrato in figura.

(b) Allineare la mascherina con i punti della posizione "A" riportati alle estremità del gel.

® Applicare la mascherina sul gel facendo aderire alla superficie prima le incisioni.

(d) Passare delicatamente le dita sulla mascherina per assicurare una perfetta aderenza.

11. Applicare 5 µL del campione lungo ogni incisione della mascherina. Attendere 10 minuti per la diffusione dopo l'applicazione dell'ultimo campione.

12. Asciugare il gel con delicatezza, con l'apposito materiale assorbente. Smaltire il materiale assorbente e la mascherina.

13. Versare 45 mL di tampone in ciascun comparto della cella elettroforetica.

14. Posizionare il gel sul ponte della cella, verificando che il (+) e il (-) del gel corrispondano con quelli indicati sul ponte. Inserire il ponte nella cella per elettroforesi Paragon e coprire la cella.

15. Collegare la cella per elettroforesi Paragon all'alimentatore. Impostare la tensione a 150 Volt, accendere ed eseguire l'elettroforesi per 25 minuti.

16. Al termine dell'elettroforesi, togliere il gel dalla cella per elettroforesi Paragon e collocarlo nel contenitore per incubazione Paragon.

AVVERTENZA

Utilizzare questo contenitore per incubazione ESCLUSIVAMENTE per gli isoenzimi della fosfatasi alcalina ISOPAL.

17. Con la pipetta per liquidi distribuire uniformemente 2,5 mL di substrato ISOPAL sulla superficie del gel. NON

TOCCARE LA SUPERFICIE DEL GEL CON la pipetta per liquidi.

18. Chiudere il contenitore per incubazione e collocarlo nell'incubatore Paragon (45°C) per 15 minuti.

19. Verificare la posizione orizzontale del contenitore per incubazione in modo che il substrato sia distribuito uniformemente sul gel.

20. Dopo 5 minuti d'incubazione, aprire il contenitore e ridistribuire il substrato uniformemente sulla superficie del gel. Proseguire l'incubazione.

21. Al termine dell'incubazione, lavare il gel nel contenitore con 20 mL di acqua deionizzata per 5 secondi, quindi con 20 mL di acido acetico al 5% per 5 minuti.

22. Posizionare il materiale assorbente sulla base del gruppo asciugatore a pressione.

23. Disporre il gel, con il lato agarosio rivolto verso l'alto, sul materiale assorbente nel gruppo asciugatore.

24. Posizionare un secondo strato di materiale assorbente inumidito con acido acetico al 5% sulla superficie del gel, seguito da 2 strati di assorbente, quindi dalla piastra superiore dell'asciugatore. Asciugare a pressione per 2 minuti.

25. Ripetere il lavaggio con acido acetico e l'asciugatura a pressione.

26. Posizionare il gel nel forno per l'essiccazione (max. 90°C) per completare l'asciugatura.

27. Valutare il gel visivamente o effettuarne la scansione con un adeguato densitometro a 600 nm.

METODI DI CONFERMA

1. Incubazione della neuraminidasi: Mescolare 100 µL del campione con 20 µL di Neuraminidasi ISOPAL (Beckman Coulter P/N 446145) e incubare per 30 minuti a 37°C. Inserire il campione originale e il campione incubato sullo stesso gel e trattare normalmente.

AVVERTENZA

È stata riscontrata una notevole variazione di attività per la neuraminidasi, in base al fornitore. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare Neuraminidasi ISOPAL per garantire la stessa attività da un lotto all'altro.

2. Trattamento con antisiero antiplacentare: Miscelare 100 µL di siero con 20 µL di Antisiero antiplacentare ISOPAL (Beckman Coulter P/N 446140) e applicare immediatamente al gel.

AVVERTENZA

Si verificheranno reazioni crociate tra gli isoenzimi intestinali e placentari, se presenti. Se è presente la frazione intestinale o placentare, il complesso con l'antisiero apparirà nella regione gamma. Inoltre, mentre l'intensità del colore del complesso può essere debole, la scomparsa di tali frazioni dalle loro posizioni originali sarà evidente. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare l'Antisiero placentare ISOPAL ad attività ottimizzata (titolo, specificità).

3. Incubazione con Ficina: Aggiungere 5 mg di Ficina ISOPAL (Beckman Coulter P/N 446150) a 100 µL di siero e incubare per 30 minuti a 37°C. Applicare il campione originale e il campione incubato sullo stesso gel e trattare normalmente.

ATTENZIONE

Irritante. Evitare il contatto con gli occhi e la pelle. Non inalare la polvere. Risciacquare abbondantemente le aree contaminate con acqua.

13. Calibrazione

Le prestazioni del densitometro devono essere verificate seguendo le istruzioni della casa produttrice.

14. Analisi dei risultati

figure 1

Il tracciato degli isoenzimi AP può essere interpretato visivamente confrontando il campione con un controllo. Si può calcolare la percentuale relativa di ciascun isoenzima AP utilizzando un densitometro.

DIFFERENZIAZIONE E CONFERMA DELLE FRAZIONI USANDO METODOLOGIE DI CONFERMA

1. Differenziazione ossa-fegato: Dopo l'incubazione con Neuraminidasi ISOPAL, appaiono due bande chiaramente risolte con migrazione decisa verso il catodo. Tali bande comprendono tutte le frazioni intestinali presenti nel campione.

2. Conferma della frazione intestinale e/o della variante intestinale:

(a) Incubare il campione una notte con Neuraminidasi ISOPAL. Le frazioni intestinali rimangono nella stessa posizione mentre quelle delle ossa e del fegato si spostano verso il catodo.

(b) Miscelare il campione con l'antisiero antiplacentare ISOPAL. Le frazioni scompaiono dalla posizione originale per apparire tra il punto di applicazione ed il catodo.

3. Conferma delle frazioni placentari:

(a) Incubare il campione con Neuraminidasi ISOPAL. Le frazioni si muovono verso il catodo.

(b) Miscelare il campione con l'antisiero antiplacentare ISOPAL. Le frazioni scompaiono e si ritrovano in una nuova posizione, tra il punto di applicazione e il catodo.

4. Conferma delle frazioni legate alle proteine: Dopo aver miscelato il campione con Ficina ISOPAL, le frazioni delle ossa e/o del fegato vengono rigenerate e il complesso presente al punto di applicazione scompare.

5. Conferma dei polimeri delle frazioni del fegato: Dopo la miscelazione con Ficina ISOPAL, la frazione del fegato viene rigenerata e il complesso presente al punto di applicazione scompare.

15. Calcolo

Non sono necessari calcoli.

16. Imprecisione

I valori del coefficiente di variazione sono normalmente inferiori al 5%.

17. Range di riferimento

In individui normali, l'attività della fosfatasi alcalina e la distribuzione degli isoenzimi dipende da età, sesso, fattori genetici e gravidanza. L'isoenzima osseo è elevato nei bambini e negli adulti che hanno superato il cinquantesimo anno di età. Individui con gruppo sanguigno B o O che sono secretori-positivi possono presentare livelli elevati di isoenzima intestinale, soprattutto dopo un pasto particolarmente ricco di grassi. L'isoenzima placentare è elevato durante la gravidanza e per un breve periodo dopo il parto.

Numerose condizioni cliniche possono inoltre modificare l'attività della fosfatasi alcalina, nonché la distribuzione degli isoenzimi. Per eseguire la lettura dei pattern elettroforetici, è necessario conoscere l'attività totale della fosfatasi alcalina nei campioni del paziente.

Per il Kit di isoenzimi della fosfatasi alcalina ISOPALI sono stati osservati i valori seguenti. Tali valori sono stati determinati su una popolazione composta da 66 residenti della California meridionale, maschi e femmine, di età compresa tra 25 e 50 anni, apparentemente in buona salute. La gamma dei valori AP totali è compresa tra 32 e 107 UI/L (37°C ASTRA).

Isoenzima AP

% attività AP totale

Osseo

da 14,8 a 73,5

Epatico

da 30,1 a 85,7

Intestinale

da 4,3 a 10,9

Macromolecolare

da 2,7 a 4,9

Si raccomanda che ogni laboratorio stabilisca la propria gamma valori normali.

18. Interferenze

1. I gel non conservati in posizione orizzontale possono produrre risultati atipici nelle separazioni elettroforetiche.

2. In presenza di emolisi, la fosfatasi alcalina totale potrebbe risultare sottostimata. Il profilo ISOPAL può indicare la presenza di una banda artefatta all'interno della frazione ossea, dovuta all'emolisi.

3. L'uso di soluzioni diverse da acqua deionizzata per diluire i tamponi e lavare i gel dopo l'incubazione può provocare la rottura del gel stesso durante l'elettroforesi nonché la precipitazione di proteine durante la fase di lavaggio.

19. Controllo Qualità

È consigliabile includere in ciascuna separazione elettroforetica sieri normali freschi o sieri di controllo disponibili in commercio.

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20. Riferimenti

Van Hoof V, Lepoutre L, De Broe M, Hoylaerts M, Chevigné R.

Improved Agarose Electrophoresis Method for Separating Alkaline Phosphatase Isoenzymes in Serum. Clin Chem 1988;34:1857-62. (Reprint R577).

Van Hoof V, Hoylaerts M, Geryl H, Van Mullem M, Lepoutre L, Debroe M.

Age and Sex Distribution of Alkaline Phosphatase Isoenzymes by Agarose Electrophoresis. Clin Chem 1990;36:875-8.

Van Hoof V, Van Oosterom A, Lepoutre L, De Broe M.

Alkaline Phosphatase Isoenzymes Patterns in Malignant Disease. Clin Chem 1992;38:2546-51.

Van Hoof V, De Broe M.

Interpretation and Clinical Significance of Alkaline Phosphatase Isoenzyme

Patterns. Crit Rev Clin Lab Sci 1994;31:197-293.

Van Hoof V, Martin M, Blockx P, Prove A, Van Oosterom A, Couttenye M, De Broe M, Lepoutre L.

Immunoradiometric Method and Electrophoresis System Compared for Quantifying Bone Alkaline Phosphatase in Serum. Clin Chem 1995;41:853-7.

Brochure Analis:

B 23 E9111 Clinical Significance of Alkaline Phosphatase Isoenzymes.

B 24a E9404 Improved Agarose Electrophoresis Method for Separating, Quantifying and

Identifying Alkaline Phosphatase Isoenzymes in Serum.


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