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ANALIS

ISOPAL™ Plus Alkaline phosphatase kit for Beckman Coulter Paragon® Electrophoresis - FR: Manuel d'instruction

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1. General

Date: septembre-03 - Révision: 01

EURO PN 844111011

PN 10-004140

100 tests par kit

2. Utilisation

Le coffret ISOPAL Plus™ d'Electrophorèse des Isoenzymes de la Phosphatase Alcaline (PA) pour utilisation sur systèmes d'électrophorèse Beckman Coulter Paragon®, est destiné à la séparation par l'électrophorèse des formes osseuses, hépatiques, intestinales, placentaires et macromoléculaires des isoenzymes de la phosphatase alcaline dans le sérum humain.

3. Principe de test

La phosphatase alcaline humaine fait partie d'un groupe d'enzymes (les hydrolases mono-esters phosphoriques) qui catalysent l'hydrolyse et le transfert d'un groupe phosphate à pH alcalin. Le coffret ISOPAL Plus PA d'Isoenzymes utilise pour la séparation électrophorétique des isoenzymes de PA un gel d'agarose tamponné. Après l'électrophorèse, les isoenzymes dans le gel sont détectées par colorimétrie selon la réaction chimique spécifique suivante.

5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) + AP à indoxyl dihalogéné (avec O2) à dimérisation en un bleu insoluble.

La coloration bleu indigo se forme à l'emplacement de chaque bande d'isoenzymes. Ce profil peut être interprété visuellement ou scannée à l'aide d'un densitomètre.

4. Contenu

Tampon d'équilibration (TRIS-borate 0.4 mol/L) 2x100mL (PN 10-004141)

Tampon d'électrophorèse (TRIS-borate 4.4 mol/L) 1x100mL (PN 10-004142)

Solution Substrat  A' (BCIP dans 2-Amino-2-Methyl-1-Propanol) 1x12.5mL (PN 10-004143)

Solution Substrat  B' (solution nitrobleu de tetrazolium) 1x12.5mL (PN 10-004145)

Isopal gels d'agarose: 1x10

contenu 25 mL 1x

Liquipipette Graduat (3mL) 1x

Matrice d'échantillon (pourpre) 1x10

Buvards pour matrices 1x10 (19x126mm)

Buvards pour gels 30 (83 x 101 mm)

Buvards séchants 20 (76 x 101mm)

5. Configuration de l'appareil

-Beckman Coulter Paragon® Système d'électrophorèse

6. Autres réactifs et matériel nécessaires

- Pipettes

- Eprouvette graduée

- De l'eau désionisée

- 5% d'acide acétique

- Beckman Coulter Paragon® Système d'électrophorèse

APPAREIL (FACULTATIF)

Un densitomètre capable de scanner un film de 3 x 4 pouces à 600 nm. L'utilisation et la calibration de l'appareil doivent être faites conformément aux instructions du fabricant.

7. Training

L'utilisateur doit bien connaître le système d'électrophorèse Paragon Beckman Coulter.

8. Préparation et conservation des réactifs

Gels ISOPAL: Juste avant l'utilisation, retirer le gel de son emballage avec précaution. Les gels doivent être conservés à température ambiante de 8 °C à 30 °C, jusqu'à la date de péremptions.

Le non-respect des conditions de température ou de conservation, peut aboutir à des migrations atypiques. NE PAS CONSERVER LES GELS A PROXIMITE D'APPAREILS QUI DIFFUSENT DE LA CHALEUR.; p.ex. CRT, ordinateur ou appareil de table. NE PAS REFRIGERER NI CONGELER.

ISOPAL Tampon d'équilibration: prêt à l'emploi.

ISOPAL Tampon d'électrophorèse, pH 9.5: Dissoudre le contenu d'un flacon de tampon d'électrophorèse (100 mL) dans 900 mL d'eau désionisée. Avant l'ouverture du flacon, le tampon doit être conservé à température ambiante, 8 °C à 30 °C, jusqu'à la date de préremption.

Le tampon dilué, conservé à température ambiante de 8 °C à 30 °C et dans un flacon hermétique, est stable pendant 60 jours ou au moins jusqu'à la date de préremption. Jeter le tampon s'il devient trouble.

Substrat ISOPAL: Verser le contenu de flacon B dans flacon A et mélanger. Se conserve 4 semaines.

9. PRELEVEMENT DES ECHANTILLONS

Les échantillons de sérum doivent être prélevés selon la procédure utilisée pour tout test de laboratoire. Il est préférable d'utiliser un sérum fraîchement prélevé sur un individu à jeun mais les échantillons pourront être conservés pendant 72 heures à 4 °C avant d'être analyés.

Les échantillons réfrigérés doivent être réactivés par incubation à une température de 37 °C pendant 30 minutes avant l'analyse. Tout échantillon présentant des signes d'hémolyse ne doit pas être utilisé.

REMARQUE

Un plasma recueilli sur oxalate, acide citrique ou EDTA inhibe toute activité de la phosphatase alcaline.

10. Mise en service du système

Voir Paragon® système d'électrophorèse.

11. Préparation de l'échantillon

Les échantillons de sérum ne sont pas dilués.

12. Procédure de l'électrophorèse

1. Ouvrir un sachet en aluminium contenant le gel ISOPAL et sortir la boîte plastique.

2. Ouvrir la boîte plastique complètement (le couvercle et le fond doivent reposer à plat sur une surface plane. Noter que le fond est strié).

3. Enlever le gel de sa boîte et le placer sur une serviette en papier.

4. Verser 20 mL de tampon d'équilibration ISOPAL dans le fond de la boîte plastique.

5. Sécher le gel délicatement avec le buvard pour gels. Jeter ce dernier.

6. Placer délicatement le gel séché, le côté agarose vers le bas, dans le tampon d'équilibration. Laisser le gel s'équilibrer pendant 30 minutes.

7. Préparer tous les échantillons et les contrôles conformément aux instructions du chapitre PRELEVEMENT DES ECHANTILLONS

8. Retirer le gel et le placer sur une serviette en papier, l'agarose vers le haut. Jeter la boîte plastique contenant le tampon d'équilibration usagé.

9 . Sécher délicatement le gel avec le buvard pour gels. Jeter ce dernier.

10. Mise en place de la matrice d'application pourpre:

figure 1

(a) Plier la matrice en la tenant entre les doigts (voir schéma).

(b) Positionner la matrice au-dessus des deux points 'A' situés sur les côtés du gel.

® Appliquer la matrice sur le gel, les fentes de la matrice devant entrer en contact les premières avec le gel.

(d) Appuyer délicatement le doigt sur toute la longueur de la matrice afin d'assurer une adhérence parfaite.

11. Déposer 5 µL d'échantillon sur chaque fente de la matrice. Laisser diffuser 10 minutes après le dernier dépôt d'échantillon.

12. Sécher délicatement la matrice avec un buvard pour matrice. Jeter le buvard et la matrice.

13. Verser 45 mL de solution tampon dans chaque compartiment du gel d'électrophorèse.

14. Placer le gel sur son support en respectant les polarités (+) et (-) figurant sur les côtés du gel et sur le support. Placer l'ensemble dans la cuve d'électrophorèse Paragon et fermer le couvercle.

15. Mettre la cuve d'électrophorèse Paragon dans la source d'alimentation. Sélectionner la tension de 150 volts, mettre l'unité sous tension et laisser migrer pendant 25 minutes.

16. L'électrophorèse terminée, retirer le gel de la cuve d'électrophorèse Paragon et l'introduire dans une boîte d'incubation Paragon.

AVIS

Cette boîte d'incubation ne doit servir que dans le cadre de la procédure ISOPAL pour les isoenzymes de la phosphatase alcaline.

17. A l'aide d'une liquipipette, distribuer de manière uniforme 2,5 ml de substrat ISOPAL sur la surface du gel. ATTENTION A CE QUE LA LIQUIPIPETTE NE TOUCHE LA SURFACE DU GEL. .

18. Fermer la boîte d'incubation et la placer dans l'incubateur PARAGON à 45 °C pendant 15 minutes.

19. Vérifier si la boîte d'incubation est placée horizontalement de façon à ce que le substrat est distribué de manière uniforme sur le gel.

20. Après 5 minutes d'incubation, ouvrir la boîte d'incubation et l'agiter délicatement pour redistribuer le substrat de manière uniforme sur la surface du gel. Continuer l'incubation.

21. Après l'incubation, rincer le gel pendant 5 secondes dans la boîte d'incubation avec 20 ml d'eau désionisée, et ensuite pendant 5 minutes avec 20 ml d'acide acétique 5%.

22. Placer le buvard de gel sur le socle de la presse.

23. Placer le gel, avec le côté d'agarose en haut, sur le buvard de gel qui se trouve sur le socle de la presse.

24. Placer un deuxième buvard de gel, humidifié avec 5 % d'acide acétique, sur la surface du gel, suivi par 2 buvards pour séchage et par le couvercle de la presse. Appuyer pendant deux minutes pour sécher.

25. Rincer encore une fois avec de l'acide acétique et sécher en tamponnant

26. Placer le gel dans une étuve jusqu'à ce qu'il soit complètement sec (max. 90 °C).

27. Interpréter le gel à l'oeil nu ou l'intégrer avec un densitomètre approprié à 600 nm.


METHODES CONFIRMATOIRES

1. Incubation en neuraminidase: mélanger 100 µL d'échantillon avec 20 µl. de neuraminidase ISOPAL (Référence Beckman Coulter 446145) et incuber pendant 30 minutes à 37 °C. Appliquer l'échantillon original et l'échantillon incubé au même gel et procéder normalement au traitement.

AVIS

On a observé une grande diversité dans l'action de la neuraminidase d'un fournisseur à l'autre. Pour obtenir les meilleurs résultats et une activité semblable entre les lots, utiliser de la neuraminidase ISOPAL.

2. Traitement avec antisérum antiplacentaire: mélanger 100 µL de sérum avec 20 µL d'antisérum antiplacentaire ISOPAL (Référence Beckman Coulter 446140) et l'appliquer immédiatement sur le gel.


AVIS

Il se produira une réaction croisée avec les isoenzymes placentaires et intestinales. En présence de fraction intestinale ou placentaire, le complexe obtenu avec l'antisérum apparaîtra dans la région gamma. De même, bien que l'intensité colorée du complexe puisse être faible, la disparition de ces fractions aux points d'origine sera évidente. Pour obtenir les meilleurs résultats possibles, utiliser l'antisérum antiplacentaire ISOPAL à activité fixe optimisée (titre, spécificité).

3. Incubation avec Ficine: ajouter 5 mg de Ficine ISOPAL (Référence Beckman Coulter 446150) à 100 µL de sérum et incuber 30 minutes à 37 °C. Appliquer l'échantillon original et l'échantillon incubé sur le même gel et les traiter normalement.

ATTENTION

Produit irritant. Eviter tout contact avec les yeux et la peau. Ne pas en respirer les poussières. Rincer toute zone contaminée à grande eau.

13. Calibration

La performance du densitomètre utilisé doit être vérifiée selon les instructions du fabricant.

14. Analyse des résultats

figure 2

Le profil électrophorétique des isoenzymes de PA peut être interprété à l'Sil nu ou par comparaison avec un profil de sérum de contrôle. Si l'on utilise un densitomètre, les pourcentages relatifs de chaque isoenzyme de PA peuvent être calculés.

DIFFERENTIATION ET CONFIRMATION DES FRACTIONS A L'AIDE DES METHODOLOGIES CONFIRMATOIRES

1. Différentiation os-foie: après l'incubation avec la neuraminidase ISOPAL, les deux bandes clairement séparées apparaîtront en migrant davantage vers la cathode. On remarquera que ces bandes couvriront toute fraction intestinale existant dans l'échantillon.

2. Confirmation d'une fraction intestinale et (ou) d'une variante intestinale:

(a) Incuber l'échantillon jusqu'au lendemain avec la neuraminidase ISOPAL. Les fractions intestinales resteront au même endroit alors que les fractions osseuses et hépatiques se déplaceront davantage vers la cathode.

(b) Mélanger avec l'antisérum antiplacentaire ISOPAL. Ces fractions disparaîtront de leur emplacement d'origine et apparaîtront entre le point d'application et la cathode.

3. Confirmation des fractions placentaires:

(a) Incuber l'échantillon avec la neuraminidase ISOPAL et les fractions se déplaceront vers la cathode.

(b) Mélanger l'échantillon avec l'antisérum antiplacentaire ISOPAL. Les fractions disparaîtront et réapparaîtront entre le point d'application et la cathode.

4. Confirmation des fractions liées au protéines: après mélange de l'échantillon avec la ficine ISOPAL, les fractions osseuses et (ou) hépatiques seront régénérées et le complexe disparaîtra au point d'application.

5. Confirmation de polymères des fractions hépatiques: après mélange avec la ficine ISOPAL, la fraction hépatique est régénérée et le complexe disparaît au point d'application.

15. Calcul

Pas de calculs nécessaires.

16. Imprécision

Les valeurs du coefficient de variation sont typiquement inférieures à 5 %

17. Gamme de référence

Chez les individus normaux, l'activité PA et la distribution des isoenzymes dépendent toutes deux de l'âge, du sexe, des caractéristiques génétiques et de l'état gestationnaire. Les isoenzymes osseux sont élevés chez l'enfant et chez l'adulte de plus de 50 ans. Les individus des groupes sanguins B ou O qui sont sécréteurs-positifs peuvent avoir des isoenzymes intestinaux élevés, particulièrement à la suite d'un repas gras. Les isoenzymes placentaires sont élevés pendant et juste après une interruption de grossesse.

D'autres conditions cliniques variées sont aussi susceptibles de modifier l'activité PA ainsi que la distribution des isoenzymes. L'interprétation des profils électrophorétiques exige une connaissance de l'activité PA totale des échantillons de patients.

Les valeurs ci-dessous ont été observées pour le coffret ISOPAL des isoenzymes de la phosphate alcaline à partir d'une population de 66 adultes hommes et femmes apparemment en bonne santé (entre 25 et 50 ans d'âge) de la Californie du Sud. La plage des valeurs PA totales se situait entre 32 et 107 U.I./L (37 °C ASTRA).

Isoenzyme PA

% d'activité PA totale

Osseux

de 14.8 à 73.5

Hépatique

de 30.1 à 85.7

Intestinal

de 4.3 à 10.9

Macromoléculaire

de 2.7 à 4.9

On recommande à chaque laboratoire d'établir sa propre gamme de référence.

18. Interférences

1. Les gels n'ayant pas été conservés dans une position horizontale peuvent produire des profils atypiques.

2. En présence d'hémolyse, la PA totale risque d'être sous-estimée. Le profil ISOPAL peut indiquer la présence d'un artéfact dans la fraction osseuse, causé par l'hémolyse.

3. L'utilisation d'eau non désionisée pour la dilution des tampons et le rinçage des gels après l'étape d'incubation risque de provoquer une rupture du gel durant l'électrophorèse et une précipitation des protéines durant les étapes de rinçage.

19. Contrôle de qualité

Il est recommandé d'inclure dans chaque procédure d'électrophorétique un pool de sérums frais et normal ou un sérum de contrôle de qualité du commerce.

20. Références

Van Hoof V, Lepoutre L, De Broe M, Hoylaerts M, Chevigné R.

Improved Agarose Electrophoresis Method for Separating Alkaline Phosphatase Isoenzymes in Serum. Clin Chem 1988;34:1857-62. (Reprint R577).

Van Hoof V, Hoylaerts M, Geryl H, Van Mullem M, Lepoutre L, Debroe M.

Age and Sex Distribution of Alkaline Phosphatase Isoenzymes by Agarose Electrophoresis. Clin Chem 1990;36:875-8.

Van Hoof V, Van Oosterom A, Lepoutre L, De Broe M.

Alkaline Phosphatase Isoenzymes Patterns in Malignant Disease. Clin Chem 1992;38:2546-51.

Van Hoof V, De Broe M.

Interpretation and Clinical Significance of Alkaline Phosphatase Isoenzyme

Patterns. Crit Rev Clin Lab Sci 1994;31:197-293.

Van Hoof V, Martin M, Blockx P, Prove A, Van Oosterom A, Couttenye M, De Broe M, Lepoutre L.

Immunoradiometric Method and Electrophoresis System Compared for Quantifying Bone Alkaline Phosphatase in Serum. Clin Chem 1995;41:853-7.

Brochures Analis:

B 23 E9111 Clinical Significance of Alkaline Phosphatase Isoenzymes.

B 24a E9404 Improved Agarose Electrophoresis Method for Separating, Quantifying and

Identifying Alkaline Phosphatase Isoenzymes in Serum.

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