Hi, I am an happy lightbox
|
|
|
|
|
|
|
|
++ 32 (0)81 25 50 50
EN | NL | FR LOGIN   
PRODUCTS SECTORS SERVICES BRANDS
PRODUCTS
SECTORS
SERVICES
BRANDS
   
ANALIS

ISOPAL™ Plus Alkaline phosphatase kit for Beckman Coulter Paragon® Electrophoresis - NL: Gebruikershandleiding

QUOTATION
INFORMATION
QUOTATION
INFORMATION
DESCRIPTION DOWNLOADS
DESCRIPTION

1. General

Datum: september-03 - Bewerking: 01
EURO PN 844111011
PN 10-004140
100 tests per kit

2. Gebruik

The ISOPAL Plus* Alkalische Fosfatase (AP) Iso-Enzym Elektroforesekit voor Beckman Coulter's Paragon® Elektroforesesysteem wordt gebruikt voor de elektroforetische scheiding van skelettaire, hepatische, intestinale, placentale en macromoleculaire vormen van alkalische fosfatase-iso-enzymen in humaan serum.

3. Testprincipe

Het humaan alkalische fosfatase-enzym behoort tot een groep enzymen (fosfor mono-ester hydrolase) die de hydrolyse en transfer katalyseren van een fosfaatgroep bij alkalische pH.

De ISOPAL Plus AP Iso-Enzym Kit zorgt voor de elektroforetische scheiding van AP-iso-enzymen in een gebufferde agarosegel. Na elektroforese worden de iso-enzymen in de gel gedetecteerd door de volgende specifieke colorimetrische chemische reactiesequens.

5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfaat (BCIP) + AP à dihalogenated indoxyl (met O2 ) à dimeriseert in een onoplosbaar blauw.

De indigoblauwe kleurstof wordt zijdelings van elke iso-enzymband gevormd. Dit patroon kan visueel geïnterpreteerd worden of gescand met een densitometer.

4. Inhoud

Equilibratiebuffer (trisboraat 0.4 mol/L) 2x100mL (PN 10-004141)

Elektroforesebuffer (trisboraat 4.4 mol/L) 1x100mL (PN 10-004142)

Substraat  A' oplossing (BCIP in 2-Amino-2-Methyl-1-Propanol) 1x12.5mL (PN 10-004143)

Substraat  B' oplossing (Nitroblauw Tetrazolium oplossing) 1x12.5mL (PN 10-004145)

Isopal Agarosegels: 1x10

Inhoud 25 mL 1x

Liquipipette Graduat (3mL) 1x

Staaltemplate (purper) 1x10

Template blotters 1x10 (19x126mm)

Gel Blotters 30 (83 x 101 mm)

Drying Blotters 20 (76 x 101mm)

5. Toestelconfiguratie

-Beckman Coulter's Paragon® Electrophoresis System.

6. Andere vereiste reagentia en benodigdheden

- Pipetten

- Maatcilinder

- Gedesioniseerd water

- 5% azijnzuur

- Beckman Coulter's Paragon® Electrophoresis System.

APPARAAT (OPTIONEEL)

Een densitometer die een film van 3 x 4 inch kan scannen bij 600 nm. Raadpleeg de gebruiksinstructies van de fabrikant voor de werkings- en kalibratieprocedure.

7. Training

De gebruiker moet vertrouwd zijn met Beckman Coulter's Paragon Electrophoresis System.

8. Bereiden en bewaren van de reagentia

ISOPAL Gels: vóór gebruik neemt u voorzichtig een gel uit de folieverpakking. Gels moeten bij kamertemperatuur bewaard worden (8 °C tot 30 °C) tot de houdbaarheidsdatum. Het niet-naleven van de temperatuur- of bewaarcondities kan resulteren in atypische migraties.

BEWAAR DE GELS NIET IN DE BUURT VAN TOESTELLEN DIE WARMTE AFGEVEN; bv. CRT, computer of tafeltoestel. KOEL ZE NIET EN VRIES ZE NIET IN.

ISOPAL Equilibratiebuffer: gebruiksklaar.

ISOPAL Elektroforesebuffer, pH 9.5: verdun de inhoud van een fles elektroforesebuffer (100 mL) met 900 mL gedesioniseerd water. Een ongeopende buffer moet bij kamertemperatuur bewaard worden (8 °C tot 30 °C) tot de houdbaarheidsdatum. Een verdunde buffer in een gesloten recipiënt en bij een kamertemperatuur van 8 °C tot 30 °C, is 60 dagen houdbaar of tot de houdbaarheidsdatum. De buffer niet meer gebruiken als hij troebel is.

ISOPAL Substraat: giet de inhoud van fles B in fles A en vermeng.

4 weken houdbaar.

9. Type specimen

De serumstalen worden gecollecteerd zoals gebruikelijk voor elke laboratoriumtest. Vers serum van een vastend individu verdient de voorkeur, maar de stalen kunnen gedurende 72 uur op 4 °C bewaard worden voor latere analyse. Gekoelde stalen moeten eerst gereactiveerd worden door een incubatie van 30 min. op 37 °C, voorafgaand aan de analyse. Gebruik geen stalen die hemolyse vertonen.

NOOT

Plasma gecollecteerd met oxalaat, citroenzuur of EDTA, verhindert de activiteit van alkalische fosfatase.

10. Opstellen van de apparatuur

Zie Paragon® Electrophoresis System

11. Staalvoorbereiding

Serumstalen worden niet verdund.

12. Gebruiksaanwijzing

1. Open de folieverpakking met ISOPAL-gel en neem het gelschaaltje er uit.

2. Open het schaaltje volledig (de boven- en onderkant van het schaaltje moeten plat op een horizontaal oppervlak liggen. Merk op dat de onderkant voorzien is van groefjes).

3. Neem de gel uit het schaaltje en plaats hem op een vel absorberend papier.

4. Giet 20 mL equilibratiebuffer ISOPAL op de bodem van het schaaltje.

5. Blot de gel voorzichtig met de gel blotter. Werp de blotter weg.

6. Leg de 'geblotte' gel, met de agarosekant naar onder, zachtjes in de equilibratiebuffer.

Equilibreer de gel gedurende 30 minuten.

7. Bereid alle stalen en controles voor zoals aangegeven in de SPECIMEN COLLECTION.

8. Verwijder de gel en plaats hem op een vel absorberend papier met de agarosekant naar boven. Werp het gelschaaltje met de gebruikte equilibratiebuffer weg.

9 . Blot de gel zachtjes met de gel blotter. Werp de blotter weg.

10. Aanbrengen van de purperen template:

figure 1

(a) Plooi de template in de lengte zoals geïllustreerd.

(b) Aligneer de template m.b.v. de 'A' lokalisatiestippen op de zijkanten van de gel.

® Breng de template aan op de gel zodat de templateputjes eerst in contact komen met het geloppervlak.

(d) Wrijf voorzichtig met de vinger over de template voor een goede hechting.

11. Breng 5 µL staal aan op elk templateputje. Nadat het laatste staal werd aangebracht, 10 minuten wachten voor een goede diffusie.

12. Blot de template voorzichtig met de template blotter. Werp blotter en template weg.

13. Giet 45 mL buffer in elk compartiment van de elektroforesegel.

14. Plaats de gel op de drager (Gel Bridge Assembly) en aligneer de positieve (+) en negatieve (-) zijde van de gel met de corresponderende posities op de drager. Plaats het geheel in de Paragon Elektroforesecel en sluit het deksel.

15. Plaats de Paragon Elektroforesecel in de power supply. Stel het voltage in op 150 volt, zet het toestel aan en voer gedurende 25 minuten een elektroforese uit.

16. Als de elektroforese beëindigd is, verwijdert u de gel uit de Paragon Elektroforesecel en plaatst u de gel in de Paragon Incubatiebox.

NOOT

Gebruik de Incubatiebox ENKEL voor de ISOPAL alkalische fosfatase iso-enzymen.

17. Verdeel met de Liquipipette gelijkmatig 2,5 ml ISOPAL substraat op het geloppervlak.

HET GELOPPERVLAK NIET MET DE LIQUIPIPETTE AANRAKEN.

18. Sluit de Incubatiebox en plaats hem gedurende 15 minuten in de Paragon Incubator (45 °C).

19. Ga na of de incubatiebox horizontaal geplaatst is zodat het substraat gelijkmatig over de gel verdeeld blijft.

20. Open de incubatiebox na 5 minuten incubatietijd en herverdeel het substraat gelijkmatig over het gel oppervlak. Laat verder incuberen.

21. Na de incubatie de gel gedurende 5 seconden spoelen in de incubatiebox met 20 ml gedesioniseerd water, daarna met 20mL 5 % azijnzuur gedurende 5 minuten.

22. Plaats de gel blotter op de pers-droger.

23. Plaats de gel, met de agarose kant naar boven, op de gel blotter die zich op de basis van de pers-droger bevindt.

24. Plaats een tweede gel blotter bevochtigd met 5 % azijnzuur op het geloppervlak, gevolgd door 2 droogblotters en de persdroger bovenplaat. Druk gedurende 2 min. droog.

25. Nogmaals met azijnzuur spoelen en droogdeppen.

26. Plaats de gel in een droogoven om te drogen (maximum 90 °C).

27. Controleer de gel op zicht of scan met een geschikte densitometer op 600 nm.


Bevestigingsmethoden

1. Incubatie met neuraminidase: meng 100 µL staal met 20 µl. ISOPAL Neuraminidase (Beckman Coulter Part Number 446145) en incubeer gedurende 30 minuten op 37 °C. Breng het originele staal en het geïncubeerde staal op dezelfde gel aan en behandel zoals gewoonlijk.

NOOT

De werking van neuraminidase kan sterk verschillen naargelang de leverancier van het product. ISOPAL Neuraminidase geeft de beste resultaten en u bent zeker van dezelfde lot-tot-lot activiteit.

2. Behandeling met antiplacentaal antiserum: meng 100 µL serum met 20 µL ISOPAL Antiplacental Antiserum (Beckman Coulter Part Number 446140) en breng het onmiddellijk aan op de gel.

NOOT

Er zal een kruisreactie ontstaan met de placentale en intestinale iso-enzymen. In aanwezigheid van een intestinale of placentale fractie, zal het complex verkregen met het antiserum, verschijnen in het gammagebied. Alhoewel de kleurintensiteit van het complex zwak kan zijn, zullen deze fracties duidelijk verdwijnen van de oorspronkelijke locaties. Gebruik ISOPAL Antiplacental Antiserum met geoptimaliseerde activiteit (titer, specificiteit) voor de beste resultaten.

3. Incubatie met ficine: voeg 5 mg ISOPAL Ficine (Beckman Coulter Part Number 446150) toe aan 100 µL serum en incubeer gedurende 30 minuten op 37 °C. Breng het originele en het geïncubeerde staal op dezelfde gel aan en behandel zoals gewoonlijk.

OPGELET

Irriterend product. Vermijd contact met de ogen en de huid. Adem geen stofdeeltjes in van het product. Elke gecontamineerde zone overvloedig met water spoelen.

13. Kalibratie

De prestaties van de densitometer moeten gecontroleerd worden volgens de instructies van de fabrikant.

14. Analyse van de resultaten

figure 2

Het elektroforetisch profiel van het AP iso-enzym kan visueel geïnterpreteerd worden door het staalpatroon te vergelijken met een controlepatroon. Met een densitometer kan men het relatieve percentage van elk AP iso-enzym berekenen.

DIFFERENTIATIE EN BEVESTIGING VAN DE FRACTIES D.M.V. DE BEVESTIGINGSMETHODOLOGIEËN

1. Skelettaire en hepatische differentiatie: na incubatie met ISOPAL Neuraminidase, zullen er twee duidelijk gescheiden banden verschijnen die meer naar de kathode migreren. Merk op dat deze banden elke intestinale fractie in het staal zullen bedekken.

2. Bevestiging van een intestinale fractie en/of een intestinale variant:

(a) Het staal een nacht incuberen met ISOPAL Neuraminidase. De intestinale fracties zullen op dezelfde plaats blijven terwijl de skelettaire en hepatische fracties zich meer naar de kathode zullen verplaatsen.

(b) Vermengen met ISOPAL Antiplacental Antiserum. Deze fracties zullen van hun oorspronkelijke locatie verdwijnen en tussen het applicatiepunt en de kathode verschijnen.

3. Bevestiging van de placentale fracties:

(a) Het staal incuberen met ISOPAL Neuraminidase en de fracties zullen naar de kathode bewegen.

(b) Het staal vermengen met ISOPAL Antiplacental Antiserum. De fracties zullen verdwijnen en opnieuw verschijnen tussen het applicatiepunt en de kathode.

4. Bevestiging van eiwitgebonden fracties: Nadat het staal vermengd werd met ISOPAL Ficin, zullen skelettaire en/of hepatische fracties geregenereerd worden en zal het complex in het applicatiepunt verdwijnen.

5. Bevestiging van polymeren van hepatische fracties: na vermenging met ISOPAL Ficin, zal de hepatische fractie regenereren en het complex in het applicatiepunt verdwijnen.

15. Berekening

Er zijn geen berekeningen vereist.

16. Onauwkeurigheid

De waarden van de variatiecoëfficiënt liggen typisch beneden 5 %.

17. Referentiebereik

Bij gezonde individuen is de AP- activiteit en de iso-enzyme verdeling afhankelijk van de leeftijd, het geslacht, de genetische en zwangerschapsfactoren. Er is een verhoogd gehalte skelettaire iso-enzymen bij kinderen en volwassenen ouder dan 50 jaar. Individuen met bloedgroep B of O en die secretorpostief zijn, kunnen verhoogde gehaltes intestinale iso-enzymen hebben, vooral na een vetrijke maaltijd. Placentale iso-enzymen zijn verhoogd tijdens en kort na het einde van de zwangerschap.

Een aantal andere klinische condities kunnen de AP-activiteit eveneens wijzigen alsook de iso-enzymverdeling. Om de elektroforetische patronen te interpreteren is kennis vereist van de totale AP-activiteit in patiëntenstalen.

< TEXT-INDENT: 0cm; 4pt 3.6pt 0cm MARGIN:>

AP Iso-Enzyme

% Totale AP-Activiteit

Bot

14.8 tot 73.5

Lever

30.1 tot 85.7

Intestinaal

4.3 tot 10.9

Macromoleculair

2.7 tot 4.9

Het is raadzaam dat elk laboratorium zijn eigen normaal bereik opstelt.

18. Interferentie

1. Gels die niet horizontaal bewaard worden, kunnen een atypisch elektroforetisch patroon ontwikkelen.

2. Als er hemolyse optreedt, kan de totale AP onderschat worden. Het ISOPAL profiel kan een artefact band vertonen binnen de botfractie, veroorzaakt door hemolyse.

3. Als men geen gedesioniseerd water gebruikt om de buffers te verdunnen en de gels te spoelen na de incubatiefase, kan de gel scheuren tijdens de elektroforese en eiwitten precipiteren tijdens de wasstappen.

19. Kwaliteitscontrole

Het is raadzaam om bij elke elektroforetische procedure normale verse sera of een commercieel beschikbaar kwaliteitscontroleserum te voegen.

20. Referenties

Van Hoof V, Lepoutre L, De Broe M, Hoylaerts M, Chevigné R.

Improved Agarose Electrophoresis Method for Separating Alkaline Phosphatase Isoenzymes in Serum. Clin Chem 1988;34:1857-62. (Reprint R577).

Van Hoof V, Hoylaerts M, Geryl H, Van Mullem M, Lepoutre L, Debroe M.

Age and Sex Distribution of Alkaline Phosphatase Isoenzymes by Agarose Electrophoresis. Clin Chem 1990;36:875-8.

Van Hoof V, Van Oosterom A, Lepoutre L, De Broe M.

Alkaline Phosphatase Isoenzymes Patterns in Malignant Disease. Clin Chem 1992;38:2546-51.

Van Hoof V, De Broe M.

Interpretation and Clinical Significance of Alkaline Phosphatase Isoenzyme

Patterns. Crit Rev Clin Lab Sci 1994;31:197-293.

Van Hoof V, Martin M, Blockx P, Prove A, Van Oosterom A, Couttenye M, De Broe M, Lepoutre L.

Immunoradiometric Method and Electrophoresis System Compared for Quantifying Bone Alkaline Phosphatase in Serum. Clin Chem 1995;41:853-7.

Analis Brochures:

B 23 E9111 Clinical Significance of Alkaline Phosphatase Isoenzymes.

B 24a E9404 Improved Agarose Electrophoresis Method for Separating, Quantifying and

Identifying Alkaline Phosphatase Isoenzymes in Serum.

DOWNLOADS
ANALIS website
This item belongs to the following categories (click to expand):
Prices are quoted in euro (taxes excluded) and apply in the Benelux (recycling fee included). They are subject to change without notice. We reserve the right to adjust pricing errors and to limit quantities.

FOLLOW US ON  FOLLOW US: