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ANALIS

ISOPAL™ Plus Alkaline phosphatase kit for Beckman Coulter Paragon® Electrophoresis - PT:Instrução de manipulação

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1. General

Date: Setembro-03 - Revisão: 01
EURO PN 844111011
PN 10-004140
100 tests por kit

2. Utilização

O kit de Electroforese de Isoenzimas de Fosfatase Alcalina ISOPAL Plus* a ser utilizado no sistema de electroforese Paragon® Beckman-Coulter é pensado para efectuar a separação electroforética dos isoenzimas da fosfatase alcalina no osso, fígado, intestino, placenta e formas macromoleculares no soro humano.

3. Princípio do teste

O enzima da fosfatase alcalina humana faz parte de um grupo de enzimas (hidrolases monoester fosfóricas) que cataliza a hidrólise e transfere o grupo fosfato num pH alcalino.

O kit Isoenzima ISOPAL Plus AP faculta a separação electroforética dos enzimas de Fosfatase Alcalina (AP) num gel de agarose tamponado. Depois da electroforese, os insoenzimas no gel são detectados pela seguinte sequência de reacções colorimétricas específicas:

5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) + AP à dihalogenated indoxyl (with O2 ) à dimeriza num azul insolúvel.

A coloração azul indigo é formada nos lugares de cada banda de insoenzima. Este padrão pode ser interpretado visualmente ou lido num densitómetro.

4. Conteúdo

Tampão de Equilíbrio) (TRIS-borate 0.4 mol/L) 2x100mL (PN 10-004141)

Tampão de Electroforese) (TRIS-borate 4.4 mol/L) 1x100mL (PN 10-004142)

Solução Substrato  A' (BCIP in 2-Amino-2-Methyl-1-Propanol) 1x12.5mL (PN 10-004143)

Solução Substrato  B' (Nitroblue Tetrazolium solution) 1x12.5mL (PN 10-004145)

Gel Agarose ISOPAL: 1x10

Medida 25 mL 1x

Liquipipette Graduada (3mL) 1x

Folha guia (purple) 1x10

Blotters Folha guia 1x10 (19x126mm)

Blotters Gel 30 (83 x 101 mm)

Blotters de Secagem 20 (76 x 101mm)

5. Configuration do instrumento

-Sistema de Electroforese Paragon® Beckman Coulter.

6. Outros reagents e materiais necessários

- Pipetas.

- Proveta graduada.

- Água desionizada.

- Ácido acético 5%.

- Sistema de Electroforese Paragon® Beckman Coulter.

INSTRUMENTO (OPCIONAL)

Um densitómetro capaz de varrimentos de películas de 3 x 4 a 600 nm. Consultar as instruções do fabricante para procedimentos de operação e calibração.

7. Treino

O utilizador deve estar familiarizado com o Sistema de Electroforese Paragon® Beckman Coulter.

8. Preparação do Reagente e armazenamento

Gel ISOPAL: Antes de usar, com cuidado remova o gel da sua embalagem. Os gel deve ser armazenado à temperatura ambiente, de 18ºC a 30ºC, até à data de expiração. Temperaturas ou condições impróprias de armazenamento podem resultar em migrações atípicas. NÃO ARMAZENE O GEL PERTO DE DISPOSITIVOS EMISSORES DE CALOR. Por exemplo: CRTs, computadores ou equipamentos de bancada. NÃO REFRIGERE OU CONGELE.

Tampão de Equilibrio ISOPAL: pronto a usar.

Tampão de Electroforese ISOPAL, pH 9.5: Diluir o conteúdo de um frasco de tampão de electroforese (100mL) com 900 mL de água desionizada. O tampão concentrado selado deve ser armazenado à tempreratura ambiente, 8°C to 30°C, até à data de expiração. O tampão diluido colocado num contentor fechado à temperatura ambiente de 18ºC a 30ºC, é estável durante 60 dias ou até à data de expiração, se mais cedo. Se o tampão se tornar turvo, elimine-o.

Substrato ISOPAL: Deite I conteúdo do frasco B no frasco A e misture. Estável por 4 semanas.

9. Tipos de especimens

As amostras séricas deverão ser colhidas da maneira normalmente usada para qualquer teste laboratorial. Amostras frescas serão preferidas mas poderão ser armazenadas a 4ºC durante 72 horas para posterior análise. As amostras refrigeradas deverão ser reactivadas por incubação a 37ºC durante 30 minutos antes de serem analizadas. Amostras com evidência de hemólise não devem ser usadas..

NOTA

Plasma colhido com oxalato, ácido cítrico, ou EDTA inibe a actividade da Fosfatase Alcalina (AP).

10. Preparação do instrumento

Ver o Sistema de Electroforese Paragon® Beckman Coulter.

11. Preparação da amostra

As amostras de soro não são diluidas.

12. Operações

1. Abra e retire a placa de gel da embalagem de ISOPAL.

2. Abra a placa completamente ( o topo e a parte inferior devem ficar direitas numa superfície nivelada. Note, por favor, que a parte inferior tem sulcos).

3. Retire o gel da placa e coloque numa toalha de papel.

4. Deite 20 mL de Tampão de Equilibrio ISOPAL na parte inferior da placa de gel.

5. Suavemente absorva o gel com o Gel Blotter. Deite fora o Blotter.

6. Suavemente coloque o gel com o lado da agarose para baixo no Tampão de Equilibrio. Equilibre o gel durante 30 minutos.

7. Prepare todas as amostras e controles de acordo com as instruções em COLECTA DE AMOSTRAS.

8. Retire o gel e coloque sobre uma toalha de papel, com o lado de agarose para cima. Retire e elimine a placa contendo o Tampão de Equilibrio.

9 . Suavemente absorva o gel com o Gel Blotter. Deite for a o Blotter.

10. Aplicação da folha Púrpura:

figure 1

(a) Dobre a folha de acordo com a ilustração.

(b) Alinha folha com os pontos de posicionamento  A localizados nos lados do gel.

® Aplique a folha no gel de modo que as ranhuras contactem o gel em primeiro lugar.

(d) Suavemente passe o dedo pela folha para assegurar a selagem.

11. Aplique 5 µL de amostra em cada ranhura da folha. Espere 10 minutos após a aplicação da última amostra.

12. Suavemente absorva a folha com o Template Blotter. Deite fora o blotter e a folha.

13. Deite 45 mL de tampão em cada compartimento da tina de electroforese.

14. Coloque o gel sobre a ponte, alinhando os terminais positivo (+) e negativo (-) com os lados correspondentes do gel. Coloque o conjunto dentro da tina de electroforese Paragon e coloque a tampa.

15. Insira a tina de electroforese Paragon na fonte de alimentação. Acerte a voltagem para 150 Volts, ligue a alimentação, e deixe funcionar durante 25 minutos.

16. Após completar a electroforese, remova o gel da célula de electroforese Paragon e coloque-o na caixa de incubação Paragon.

AVISO

Utilize esta caixa de incubação SÓ para Isoenzimas da Fosfatase Alcalina ISOPAL.

17. Distribua 2.5 mL de substrato ISOPAL uniformemente na superfície do gel com Liquipipette. EVITE TOCAR A SUPERFÍCIE DO GEL Liquipipette.

18. Feche a caixa de incubação e coloque no Incubador Paragon (45ºC) durante 15 minutos.

19. Verifique a posição horizontal da caixa de incubação de modo a que o substrato permaneça uniformemente distribuido sobre o gel.

20. Após 5 minutos de incubação, abra a caixa de incubação e redistribua o substrato uniformemente sobre a superfície do gel. Continue a incubação.

21. Depois da incubação, passe o gel na caixa de incubação com 20 mL de água desionizada durante 5 segundos, em seguida com 20 mL de ácido acético a 5% durante 5 minutos.

22. Coloque o Gel Blotter sobre a Base do Secador por Pressão.

23. Coloque o gel, com o lado da agarose para cima, sobre o Gel Blotter na Base do Secador por Pressão.

24. Coloque um Segundo Gel Blotter humedecido com ácido acético a 5% sobre a superficie do gel, seguido por 2 blotters de secagem e pressione a placa superior do secador. Pressione durante durante 2 minutos.

25. Repita a lavagem com ácido acético e pressione a para secar.

26. Coloque o gel no forno de secagem até secar (máximo 90ºC)

27. Avalie o gel visualmente ou scan num densitómetro apropriado a 600 nm.

MÉTODOS CONFIRMATÓRIOS

1. Incubação da Neuraminidase: Misture 100 µL de amostra com 20 µL de Neuraminidase ISOPAL ( Referência Beckman Coulter 446145) e incube durante 30 minutos 37°C. Aplique a amostra original e incube a amostra no mesmo gel e processe normalmente.

AVISO

Uma grande diversidade na acção da neuraminidase foi encontrada, dependendo do fornecedor. Para melhores resultados, utilize a Neuraminidase ISOPAL para assegurar a mesma actividade de lote para lote.

2. Tratamento com Antisoro Antiplacental : Misture 100 µL de soro com 20 µL de Antisoro Antiplacental ISOPAL (Referência Beckman Coulter 446140) e aplique ao gel imediatamente.

AVISO

Uma reacção cruzada com os isoenzimas placentais e intestinais, se presentes, ocorrerá. Se a fracção placental ou intestinal estiver presente, o complexo com antisoro aparecerá na região gama. Também, enquanto a intensidade da cor do complexo poderá ser fraca, o desaparecimento destas fracções das posições originais será óbvia. Para os melhores resultados utilize o Antisoro Antiplacental ISOPAL com actividade optimizada (titulação, especificidade).

3. Incubação com Ficina: Adicione 5 mg de Ficina ISOPAL (Referência Beckman Coulter 446150) a 100 µL de soro e incube durante 30 minutos a 37°C. Aplique a amostra original e incube a amostra no mesmo gel. Processe normalmente.

CUIDADO

Irritante. Evite o contacto com os olhos e pele. Não respire o pó. Lave a área contaminada com água abundantemente.

13. Calibração

A performance do densitómetro deve ser verificada de acordo com as instruções do fabricante.

14. Análise dos resultados

figure 2

O formato do isoenzima da Fosfatase Alcalina pode ser visualmente interpretada por comparação do formato da amostra com o formato do controle. Com a utilização de um densitómetro,

A percentagem relativa de cada isoenzima pode ser calculada.

DIFFERENCIAÇÃO E CONFIRMAÇÃO DAS FRACÇÕES USANDO METODOLOGIAS CONFIRMATÓRIAS.

1. Diferenciação Osso-Fígado: Depois da incubação com Neuraminidase ISOPAL, duas bandas claramente resolvidas aparecerão migrando no sentido catódico. Estas bandas cobrirão qualquer fracção intestinal existente na amostra.

2. Confirmação da Fracção Intestinal e/ou Variante Intestinal:

(a) Incube durante a noite com Neuraminidase ISOPAL. As fracções intestinais ficarão na mesma posição enquanto as fracções de osso e fígado se moverão catodicamente.

(b) Misture com Antisoro Antiplacental ISOPAL. Estas fracções desaparecerão da posição original e aparecerão entre o ponto de aplicação e o cátodo.

3. Confirmação da Fracções Placentais:

(a) Incube a amostra com ISOPAL A Neuraminidase e as fracções mover-se-ão catodicamente.

(b) Misture a amostra com o Antisoro Antiplacental ISOPAL . As fracções mudarão para uma nova posição entre o ponto de aplicação e o cátodo.

4. Confirmação das Fracções de Ligações de Proteinas: Após misturar a amostra com Ficina ISOPAL, as fracções osso e/ou figado serão regeneradas e o complexo no ponto de aplicação desaparecerá.

5. Confirmação dos Polímeros da Fracções do Fígado: Após misturar com a Ficina ISOPAL, a fracção do fígado regenera e o complexo na aplicação desaparece.

15. Cálculos

Não são requeridos cálculos.

16. Imprecisão

O coeficiente de variação é tipicamente abaixo de 5 %.

17. Gama de Referência

Em indivíduos normais a actividade da Fosfatase Alcalina tal como a distribuição de isoenzimas é dependente da idade, sexo, genética e gravidez.. O isoenzima ósseo é elevado em crianças e adultos acima dos 50 anos. Indivíduos com o tipo de sangue B ou O e sejam secretors-positivos poderão ter isoenzimas intestinais elevados, particularmente depois de uma refeição gorda. O isoenzima placentário é elevado durante e por pouco tempo após a gravidez.

Um número de outras condições clínicas podem também modificar a actividade da fosfatase alcalina, assim como a distribuição de isoenzimas. Interpretação dos padrões electroforéticos requer o conhecimento da actividade da Fosfatase Alcalina total nas amostras dos pacientes.

Os seguintes valores foram observados para o kit de Isoenzima de Fosfatase Alcalina ISOPAL quando determinados de uma população de 66 aparentemente saudáveis adultos, homens e mulheres (idades de 25 a 50 anos) da Califórnia do Sul. A variação dos valores para a Fosfatase Alcalina Total foi de 32 a 107 IU/L (37ºC ASTRA).

Isoenzima AP

% da Actividade AP Total

Osso

14.8 to 73.5

Fígado

30.1 to 85.7

Intestinal

4.3 to 10.9

Macromolecular

2.7 to 4.9

É recomendado que cada laboratório estabeleça os seus próprios valores de referência.

18. Interferencia

1. Géis não armazenados numa posição horizontal podem produzir padrões electroforéticos atípicos.

2. Na presença de hemólise a AP total pode ser subestimada. O perfil ISOPAL pode mostrar a presença de uma banda artefactual na fracção óssea, causada pela hemólise.

3. O uso de outro líquido além de água desionizada para diluir os tampões e lavagens do gel depois do passo de incubação pode causar a ruptura do gel durante a electroforese e também precipitar proteinas durante os passos de lavagens.

19. Controle de Qualidade

É recomendado o uso de soro normal, fresco, ou controle de qualidade comercialmente disponível ,em soro, para cada processo electroforético.

20. Referências

Van Hoof V, Lepoutre L, De Broe M, Hoylaerts M, Chevigné R.

Improved Agarose Electrophoresis Method for Separating Alkaline Phosphatase Isoenzymes in Serum. Clin Chem 1988;34:1857-62. (Reprint R577).

Van Hoof V, Hoylaerts M, Geryl H, Van Mullem M, Lepoutre L, Debroe M.

Age and Sex Distribution of Alkaline Phosphatase Isoenzymes by Agarose Electrophoresis. Clin Chem 1990;36:875-8.

Van Hoof V, Van Oosterom A, Lepoutre L, De Broe M.

Alkaline Phosphatase Isoenzymes Patterns in Malignant Disease. Clin Chem 1992;38:2546-51.

Van Hoof V, De Broe M.

Interpretation and Clinical Significance of Alkaline Phosphatase Isoenzyme

Patterns. Crit Rev Clin Lab Sci 1994;31:197-293.

Van Hoof V, Martin M, Blockx P, Prove A, Van Oosterom A, Couttenye M, De Broe M, Lepoutre L.

Immunoradiometric Method and Electrophoresis System Compared for Quantifying Bone Alkaline Phosphatase in Serum. Clin Chem 1995;41:853-7.

Brochuras Analis :

B 23 E9111 Clinical Significance of Alkaline Phosphatase Isoenzymes.

B 24a E9404 Improved Agarose Electrophoresis Method for Separating, Quantifying and

Identifying Alkaline Phosphatase Isoenzymes in Serum.

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