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ANALIS

Isoamyl™ kit for Beckman Coulter Paragon® Electrophoresis - ES: Instrucciones de uso

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DESCRIPTION TECHNICAL DESCR.
DESCRIPTION

1. General

Fecha: Septiembre 2003 - Revisión: 01
EURO PN 844111001
PN 10-004050
100 pruebas por kit

2. Uso previsto

Para la separación de las isoenzimas de la α-amylasa en suero por electroforesis en gel de agarosa.

3. Principio del ensayo

El estuche Isoamyl se suministra con un tampón borato a pH 6,95 para separación por electroforesis en gel de agarosa. Como sustrato se utiliza el rectivo Phadebas® (Pharmacia Diagnostics) para la obtención de las fracciones teñidas.

El sustrato es un polímero de almidón reticular insoluble en agua marcado con un colorante azul. Se hidroliza por la acción de la α-amilasa formando fragmentos azules hidrosolubles.

4. Contenido

Tampón Electroforético (TRIS borato 1,5 mol/l) 2x200ml (PN 10-004051)

Tampón Equilibrador (TRIS borato 0,6 mol/l)1x200ml (PN 10-004052)

Sustrato Isoamilo (Phadebas® Pharmacia Diagnostics) 30 pastillas (PN 10-004053)

Geles de agarosa: 1x10

Medida de 25 ml 1x

Pinzas de plástico 1x

Pipeta para líquidos graduada (3ml) 1x

Plantilla para la muestra (color violeta) 1x10

Secantes para plantillas 1x10 (19x126mm)

Secantes para geles 20 (83 x 101 mm)

5. Configuración del aparato

  • Sistema de electroforesis Beckman Coulter Paragon ®.

6. Otros reactivos y materiales necesarios

  • Pipetas.
  • Bureta graduada.
  • Agua desionizada.
  • Sistema de electroforesis Beckman Coulter Paragon ®.

INSTRUMENTAL (OPCIONAL)

Un densitómetro capaz de explorar gel electroforético de 7,5 cm x 10 cm a 600 nm. Consultar las especificaciones del fabricante sobre los procedimientos de calibración y operación.

7. Formación

El operador deberá estar familiarizado con el Sistema de electroforesis Beckman Coulter Paragon®.

8. Preparación de reactivos y almacenamiento

Tampón de electroforesis Mezclar 400 ml de tampón con 600 ml de agua desionizada.

El tampón permanece estable en frasco cerrado durante 60 días.

Sustrato: 3 pastillas de Phadebas® en 6 ml de agua desionizada.

9. Tipo de muestra


Las muestras de suero deben obtenerse siguiendo los procedimientos normales para cualquier prueba de laboratorio. Se prefiere utilizar suero recientemente extraído de un individuo en ayunas, aunque las muestras pueden almacenarse a 4°C durante un período de hasta 72 horas para su posterior anàlisis. Las muestras refrigeradas deben reactivarse, incubándolas a una temperatura de 37°C durante 30 minutos antes de analizarlas. No deben usarse muestras que presenten indicios de hemólisis.


10. Preparación del equipo

Véase el sistema de electroforesis Paragon ®

reutilizable para 10 geles

11. Preparación de la muestra

No hay que diluir las muestras de suero.

12. Operaciones

Equilibrado

  • Secar el gel
  • Verter 20 ml de tampón equilibrador en la bandeja (lista para ser utilizada)
  • Colocar el gel, con la agarosa hacia abajo, sobre el líquido.
  • Esperar durante 30 minutos (no cerrar el contenedor)

Aplicación

  • Secar el gel
    EVITAR EL DEPÓSITO DE AMILASA PROCEDENTE DE LOS DEDOS O LA SALIVA SOBRE EL GEL.
  • Colocar la plantilla para la muestra
    Consultar la ilustración sobre la alineación de la plantilla

figure 1

  • Dispensar 5 µl de la muestra
    (las muestras con actividad amilasa superior al doble del límite superior normal deberán ser aplicadas durante un tiempo más corto: de 1 a 3 min)
  • Esperar durante 5 minutos
  • Secar suavemente la plantilla con el secante para plantillas
  • Retirar y desechar el secante y la plantilla

Electroforesis

  • Verter 45 ml de tampón de electroforesis en cada compartimiento de la celda
  • Colocar el gel sobre el puente
  • Separar durante 50 minutos a 150 voltios

Detección

  • Colocar el gel en la caja de incubación
  • Distribuir uniformemente sobre el gel con la pipeta para líquidos la suspensión de 3 pastillas de sustrato en 6 ml de agua desionizada.
  • Cubrir la caja
  • Incubar durante una hora a 45°C sin mover la caja
  • Lavar el gel bajo el agua del grifo.

13. Calibrado

El funcionamiento del densitómetro debe verificarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

14. Análisis de resultados

El patrón de isoenzimas de la amilasa puede interpretarse visualmente sobre el gel mojado o puede explorarse con un densitómetro a 600 nm para obtener el porcentaje relativo de cada isoenzima de la amilasa.

15. Cálculos

Las fracciones pueden recalcularse a partir de la actividad de la amilasa total.

Por ejemplo.

Actividad total 35 U/l

La fracción P2 de 12% da 4 U/l

La fracción S2 de 58% da 20 U/l

La fracción S2 de 27% da 10 U/l

La fracción S4 de 3% da 1 U/l

16. Imprecisión y sensibilidad

Para N = 10 y amilasa = 84 U/l

En el interior del gel

Entre el gel

U/l

%CV

U/l

%CV

P2

18,1

1,4

18,4

3,8

S2

46,4

2,1

46,6

2,9

S3

16,1

3,5

15,9

9,1

S4

3,3

14,6

3,3

20,3

La sensibilidad permite la detección de fracciones con actividades tan bajas como 1 U/l.

17. Límites de referencia

Cada laboratorio deberá establecer sus propios límites de referencia de acuerdo con la población de pacientes.

Valores de referencia establecidos a partir de 1.300 individuos sanos:

Actividad amilasa total (*)

24 U/l

72 U/l

P2

9

32

P3

0

2

S2

7

42

S3+S4

1

6

(*) la actividad amilasa total fue determinada a 25 °C con reactivos Wako.

18. Interferencias

Ninguna conocida.

19. Control de Calidad

Se recomienda incluir suero fresco normal o suero control disponible comercialmente en cada procedimiento electroforético.

20. Referencias

Bibliografía.

Van Hoof V, Michielsen P, Roelandt R et al.

Evaluation of the Isoamyl system and its application in a prospective study of serum amylase after endoscopy. Biologie Prospective. Comptes rendus du 7ième colloque de Pont-à-Mousson,1989:261-4

Van Hoof V, Geeraerts L, Van Meirvenne H, Van Mullem M, Chevigné R, Van Campenhout C, Lepoutre L.

Reference Values for Amylase Isoenzymes Determined by Agarose Electrophoresis. Clin Chem 1990;36:1151-2.

Michielsen P, Van Hoof V, Lepoutre L, Van Maercke Y.

Klinische Toepassingen van de Isoamylasenbepaling. Tijdschr. voor Geneeskunde 1990;46:1251-6

Textos de Análisis:

B 53 E9702 α-Amylase Isoenzymes separation by agarose gel electrophoresis.

B 54 D9703 Trennung der α-Amylase-Isoenzyme auf Agarosegelen.

TECHNICAL DESCR.
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