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ANALIS

Isoamyl™ kit for Beckman Coulter Paragon® Electrophoresis - IT: Istruzioni per l'uso

QUOTATION
INFORMATION
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DESCRIPTION TECHNICAL DESCR.
DESCRIPTION

REVISION 2

1. General
2. Finalità di utilizzo
3. Principio del test
4. Contenuto
5. Configurazione dello strumento
6. Altri reagenti e materiale necessario
7. Formazione
8. Preparazione dei reagenti e stoccaggio
9. Tipologia di campione
10. Preparazione dello strumento
11. Preparazione del campione
12. Operazioni
13. Calibrazione
14. Analisi dei risultati
15. Calcolo
16. Imprecisione e sensibilità
17. Range di riferimento
18. Interferenze
19. Controllo Qualità
20. Riferimenti

1. General

Data: Settembre 03  Revisione: 01
EURO PN 844111001
PN 10-004050
100 test per kit

2. Finalità di utilizzo

Per la separazione degli isoenzimi dell'α-amilasi nel siero tramite elettroforesi su gel di agarosio.

3. Principio del test

Il kit Isoamyl utilizza un tampone borato a pH 6,95 per la separazione elettroforetica su gel di agarosio. Per ottenere le frazioni colorate si utilizza come substrato un reagente Phadebas® (Pharmacia Diagnostics).

Il substrato è un polimero ramificato dell'amido insolubile in acqua, che trasporta un colorante blu. Tale polimero viene idrolizzato dall'α-amilasi formando frammenti blu idrosolubili.

4. Contenuto

Tampone per elettroforesi (TRIS-borato 1,5 mol/L) 2x200 mL (PN 10-004051)

Tampone per equilibrazione (TRIS-borato 0,6 mol/L) 1x100 mL (PN 10-004052)

Substrato Isoamyl(Phadebas® Pharmacia Diagnostics) 30 tavolette

Gel di agarosio: 1x10

Contenitore graduato 25 mL 1x

Pinze in plastica 1x

Pipetta graduata per liquidi (3 mL) 1x

Mascherina per campioni (viola) 1x10

Assorbenti per mascherina 1x10 (19 x 126 mm)

Assorbenti per gel 20 (83 x 101 mm)

5. Configurazione dello strumento

- Sistema elettroforetico Paragon ® Beckman Coulter

6. Altri reagenti e materiale necessario

  • Pipette.
  • Cilindro graduato.
  • Acqua deionizzata.
  • Sistema elettroforetico Paragon ® Beckman Coulter

STRUMENTO (OPZIONALE)

Densitometro con possibilità di effettuare la scansione di supporti da 7,5 x 10 cm a 600 nm. Per le procedure d'uso e calibrazione, consultare le istruzioni della casa produttrice.

7. Formazione

L'operatore deve conoscere il sistema elettroforetico Paragon di Beckman Coulter.

8. Preparazione dei reagenti e stoccaggio

Tampone per elettroforesi Miscelare 400 mL di tampone con 600 mL di acqua deionizzata.

Il tampone conservato in contenitore chiuso è stabile per 60 giorni.

Substrato: 3 tavolette di Phadebas® in 6 mL di acqua deionizzata.

9. Tipologia di campione

I campioni di siero possono essere raccolti con le normali tecniche usate in laboratorio. È consigliabile l'uso di campioni freschi di siero prelevati da individui a digiuno, ma è possibile conservarli a 4°C per 72 ore. I campioni conservati in frigo devono essere riattivati prima dell'analisi tramite incubazione a 37°C per 30 minuti. I campioni che presentano tracce di emolisi non devono essere usati.

10. Preparazione dello strumento

Vedere sistema elettroforetico Paragon®.

RIUTILIZZABILE PER 10 GEL

11. Preparazione del campione

I campioni di siero non vengono diluiti.

12. Operazioni

Equilibrazione

  • Asciugare il gel
  • Versare 20 mL di tampone per l'equilibrazione nel vassoietto gel (pronto all'uso)
  • Posizionare il gel nel liquido, con il lato dell'agarosio rivolto verso il basso.
  • Attendere 30 minuti (non chiudere il contenitore)

Applicazione

  • Asciugare il gel
    NON TOCCARE IL GEL CON LE DITA O LA SALIVA PER EVITARE DI TRASFERIRE AMILASI.
  • Posizionare la mascherina campioni
    Per l'allineamento della mascherina fare riferimento alla figura.

figure 1

  • Dispensare 5 µL di campione
    (i campioni con attività amilasica due volte superiore al normale devono essere applicati per un tempo inferiore: da 1 a 3 minuti)
  • Attendere per 5 minuti
  • Asciugare la mascherina con delicatezza, con l'apposito materiale assorbente
  • Rimuovere e smaltire il materiale assorbente e la mascherina

Elettroforesi

  • Versare 45 mL di tampone per elettroforesi in ciascun comparto della cella elettroforetica.
  • Posizionare il gel sul ponte
  • Separare per 50 minuti a 150 volt.

Rilevamento

  • Disporre il gel nel contenitore di incubazione
  • Mediante la pipetta graduata per liquidi, distribuire uniformemente sulla parte superiore del gel la sospensione delle 3 tavolette di substrato in 6 mL di acqua deionizzata.
  • Coprire il contenitore
  • Incubare per un'ora a 45°C senza spostare il contenitore
  • Lavare il gel con acqua di rubinetto.

13. Calibrazione

Le prestazioni del densitometro devono essere verificate seguendo le istruzioni della casa produttrice.

14. Analisi dei risultati

Il tracciato degli isoenzimi dell'amilasi può essere interpretato visivamente sul gel bagnato o analizzato mediante un densitometro a 600 nm, sempre su gel bagnato, per ottenere le percentuali relative di ogni isoenzima.

15. Calcolo

Le frazioni possono essere ricalcolate dall'attività totale dell'amilasi.

Ad esempio:

Attività totale 35 U/L

Frazione P2, 12% = 4 U/L

Frazione S2, 58% = 20 U/L

Frazione S2, 27% = 10 U/L

Frazione S4, 3% = 1 U/L

16. Imprecisione e sensibilità

Per N = 10 e amilasi = 84 U/L

Nel gel

Fra gel

U/L

CV %

U/L

CV %

P2

18,1

1,4

18,4

3,8

S2

46,4

2,1

46,6

2,9

S3

16,1

3,5

15,9

9,1

S4

3,3

14,6

3,3

20,3

La sensibilità consente di determinare frazioni con attività fino a 1 U/L.

17. Range di riferimento

Ogni laboratorio dovrebbe stabilire un proprio range di riferimento in base alla popolazione di pazienti.

Valori di riferimento determinati su 1300 individui sani:

Attività totale amilasi (*)

24 U/L

72 U/L

P2

9

32

P3

0

2

S2

7

42

S3+S4

1

6

(*) l'attività totale dell'amilasi è stata determinata a 25°C con reagenti Wako.

18. Interferenze

Nessuna conosciuta.

19. Controllo Qualità

È consigliabile includere in ciascuna separazione elettroforetica sieri normali freschi o sieri di controllo disponibili in commercio.

20. Riferimenti

Bibliografia.

Van Hoof V, Michielsen P, Roelandt R et al.

Evaluation of the Isoamyl system and its application in a prospective study of serum amylase after endoscopy. Biologie Prospective. Comptes rendus du 7ième colloque de Pont-à-Mousson,1989:261-4

Van Hoof V, Geeraerts L, Van Meirvenne H, Van Mullem M, Chevigné R, Van Campenhout C, Lepoutre L.

Reference Values for Amylase Isoenzymes Determined by Agarose Electrophoresis. Clin Chem 1990;36:1151-2.

Michielsen P, Van Hoof V, Lepoutre L, Van Maercke Y.

Klinische Toepassingen van de Isoamylasenbepaling. Tijdschr. voor Geneeskunde 1990;46:1251-6

Brochure Analis:

B 53 E9702 α-Amylase Isoenzymes separation by agarose gel electrophoresis.

B 54 D9703 Trennung der α-Amylase-Isoenzyme auf Agarosegelen.

TECHNICAL DESCR.
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