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ANALIS

Isoamyl™ kit for Beckman Coulter Paragon® Electrophoresis - FR: Manuel d'instruction

QUOTATION
INFORMATION
QUOTATION
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DESCRIPTION TECHNICAL DESCR.
DESCRIPTION

REVISION 02

1. General
2. Utilisation
3. Principe de test
4. Contenu
5. Configuration de l'appareil
6. Autres réactifs et matériel nécessaires
7. Training
8. Préparation et conservation des réactifs
9. Prélèvement des échantillons
10. Mise en service du système
11. Préparation de l'échantillon
12. Procédure d'utilisation
13. Calibration
14. Analyse des résultats
15. Calcul
16. Imprécision et sensibilité
17. Gamme de référence
18. Interférences
19. Contrôle de qualité
20. Références

1. General

Date: 9 mai 2005 - Révision: 02
EURO PN 844111001
PN 10-004050
100 tests par kit

2. Utilisation

Pour la séparation d'isoenzymes d'α-amylase dans du sérum par electrophorèse en gel d'agarose.

3. Principe de test

Le coffret Isoamyl comprend un tampon borate de pH 6,95 pour la séparation électrophorétique sur gels d'agarose. Pour obtenir les fractions colorées, on utilise un réactif Phadebas® (Pharmacia Diagnostics) en tant que substrat.

Le substrat est un polymère d'amidon réticulé insoluble dans l'eau avec un colorant bleu. Il est hydrolysé par l'α-amylase et crée des fragments bleus, solubles dans l'eau.

4. Contenu

Tampon d'électrophorèse: (TRIS-borate 1.5 mol/L) 2x200mL (PN 10-004051)

Tampon d'équilibration (TRIS-borate 0.6 mol/L) 1x200mL (PN 10-00452)

Substrat d'Isoamyl (Phadebas® Pharmacia Diagnostics) 30 comprimés (PN 10-004053)

Gel d'agarose : 1x10

Contenu: 25 mL 1x

Pince en plastique 1x

Liquipipette Graduat (3mL) 1x

Matrice d'échantillon (pourpre) 1x10

Buvards pour matrices 1x10 (19x126mm)

Buvards pour gels 20 (83 x 101 mm)

5. Configuration de l'appareil

  • Beckman Coulter Paragon® Système d'Electrophorèse

6. Autres réactifs et matériel nécessaires

  • Pipettes
  • Eprouvette graduée
  • De l'eau désionisée
  • Beckman Coulter Paragon® Système d'Electrophorèse

APPAREIL (FACULTATIF)

Un densitomètre capable de scanner un film de 3 x 4 pouces à 600 nm. L'utilisation et la calibration de l'appareil doivent être faites conformément aux instructions du fabricant.

7. Training

L'utilisateur doit bien connaître le Système d'Electrophorèse Paragon Beckman Coulter.

8. Préparation et conservation des réactifs

Tampon d'électrophorèse: mélanger 400mL de tampon avec 600mL d'eau désionisée. Le tampon se conserve pendant 60 jours dans un récipient fermé.

Substrat: 3 comprimés Phadebas® dans 6 mL d'eau désionisée.

9. Prélèvement des échantillons



Les échantillons de sérum doivent être prélevés selon la procédure utilisée pour tout test de laboratoire. Il est préférable d'utiliser un sérum fraîchement prélevé sur un individu à jeun mais les échantillons pourront être conservés pendant 72 heures à 4 °C avant d'être analyés.

Les échantillons réfrigérés doivent être réactivés par incubation à une température de 37 °C pendant 30 minutes avant l'analyse. Tout échantillon présentant des signes d'hémolyse ne doit pas être utilisé.

10. Mise en service du système

Voir Paragon® système d'électrophorèse

REUTILISABLE POUR 10 GELS

11. Préparation de l'échantillon

Les échantillons de sérum ne sont pas dilués.

12. Procédure d'utilisation

Equilibration

  • Sécher le gel
  • Verser 20 mL de tampon d'équilibration dans le fond de la boîte plastique (prêt à l'emploi)
  • Placer le gel, le côté agarose vers le bas, sur le liquide.
  • Attendre 30 minutes (ne pas fermer le récipient)

Application

  • Sécher le gel
    NE PAS METTRE D'AMYLASE SUR LE GEL AVEC LES DOIGTS OU LA SALIVE.
  • Positionner la matrice d'échantillon.
    Observer la représentation pour un alignement correct de la matrice.

figure 2

  • Pipetter un échantillon de 5 µL
    (les échantillons avec une activité d'amylase de plus de 2x la valeur normale supérieure, doivent être appliqués plus court: 1 à 3 minutes.)
  • Attendre 5 minutes
  • Sécher la matrice délicatement avec le buvard de matrice.
  • Jeter buvard et matrice.

Electrophorèse

  • Verser 45 mL de tampon d'électrophorèse dans chaque compartiment de la cuve.
  • Placer le gel sur le support.
  • Effectuez une séparation à 150 volts pendant 45 min.

Détection

  • Placer le gel dans la boîte d'incubation.
  • A l'aide de la liquipipette, appliquer de manière uniforme la suspension de 3 comprimés de substrat dans 6 mL d'eau désionisée sur le gel.
  • Fermer la boîte.
  • Incuber à 45 °C pendant une heure sans bouger la boîte
  • Rincer le gel sous le robinet.

13. Calibration

La performance du densitomètre utilisé doit être vérifiée selon les instructions du fabricant.

14. Analyse des résultats

La structure de l'isoenzyme d'amylase peut être interprété à l'Sil nu sur le gel humide ou analysé par scan humide avec un densitomètre à 600 nm pour connaître le pourcentage relatif de chaque isoenzym d'amylase.

15. Calcul

Sur base de l'activité totale d'amylase on peut recalculer les fractions.

Par exemple:

Activité totale 35 U/L

Fraction P2 de 12 % est de 4U/L

Fraction S2 de 58 % est de 20U/L

Fraction S2 de 27 % est de 10U/L

Fraction S4 de 3 % est de 1U/L

16. Imprécision et sensibilité

Quand N=10 et amylase = 84 U/L

Intra-gel

Inter-gel

U/L

%CV

U/L

%CV

P2

18.1

1.4

18.4

3.8

S2

46.4

2.1

46.6

2.9

S3

16.1

3.5

15.9

9.1

S4

3.3

14.6

3.3

20.3

La sensibilité offre la détection de fractions avec une activité de seulement 1 U/L.

17. Gamme de référence

Chaque laboratoire devrait établir sa propre gamme de référence conformément à la population de patients.

Valeurs référentielles à partir de 1300 individus sains:

Activité totale d'amylase (*)

24 U/L

72 U/L

P2

9

32

P3

0

2

S2

7

42

S3+S4

1

6

(*) L'activité totale d'amylase a été déterminée à 25 °C avec des réactifs Wako.

18. Interférences

Pas connu.

19. Contrôle de qualité

Il est recommandé d'inclure dans chaque procédure électrophorétique un pool de sérums frais ou un sérum de contrôle de qualité du commerce.

20. Références

Bibliographie

Van Hoof V, Michielsen P, Roelandt R et al.

Evaluation of the Isoamyl system and its application in a prospective study of serum amylase after endoscopy. Biologie Prospective. Comptes rendus du 7ième colloque de Pont-à-Mousson,1989:261-4

Van Hoof V, Geeraerts L, Van Meirvenne H, Van Mullem M, Chevigné R, Van Campenhout C, Lepoutre L.

Reference Values for Amylase Isoenzymes Determined by Agarose Electrophoresis. Clin Chem 1990;36:1151-2.

Michielsen P, Van Hoof V, Lepoutre L, Van Maercke Y.

Klinische Toepassingen van de Isoamylasenbepaling. Tijdschr. voor Geneeskunde 1990;46:1251-6

Brochures Analis:

B 53 E9702 α-Amylase Isoenzymes separation by agarose gel electrophoresis.

B 54 D9703 Trennung der α-Amylase-Isoenzyme auf Agarosegelen.

TECHNICAL DESCR.
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